子宮內膜癌鞘氨醇激酶－1與1－磷酸鞘氨醇的表達和意義

黃金智，衛(wèi)月，郭潤民

（1.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，湛江 524001；2.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院心血管內科，湛江 524001）

近年來研究［1］發(fā)現(xiàn)，鞘脂在惡性腫瘤的進展和轉移中有重要作用，其中鞘磷脂的代謝產(chǎn)物神經(jīng)酰胺、神經(jīng)鞘氨醇和 1－磷酸鞘氨 醇 （sphingosine－1－phosphate，S1P）參與調節(jié)細胞的增殖、存活和凋亡，發(fā)揮著十分重要的作用。鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SphK）是控制鞘脂代謝平衡的關鍵酶，其中SphK1在多種實體腫瘤中均有表達，且其基因具有癌基因的特征。它主要通過SphK1／S1P信號通路促進腫瘤細胞生長，保護其免受凋亡，使其產(chǎn)生放化療耐受的作用，因而抑制SphK1活性對抗腫瘤有重要意義［1，2］，然而 SphK1／S1P信號通路在人子宮內膜癌的具體生物學作用及機制尚不清楚。因此，本研究擬探討SphK1／S1P信號通路在人子宮內膜癌的變化和可能作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2009年7月～2013年12月在廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的子宮內膜癌患者，子宮內膜癌的診斷經(jīng)診斷性刮宮和病理檢查確診。正常子宮內膜和血漿標本23例（control組），正常子宮內膜取自行子宮全切手術的子宮肌瘤患者的瘤旁組織，其中增生期12例，分泌期11例。子宮內膜癌標本和血漿標本52例（EMC組），取自行子宮全切手術的子宮內膜癌患者，按照2009年FIGO手術病理分期，其中Ⅰ期31例，Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期10例；組織學分級，G1級24例，G2級16例，G3級12例；無肌層浸25例，淺肌層浸潤16例，深肌層浸潤11例。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，患者均簽署知情同意書。

1.2 材料與試劑

SphK1抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，組織SphK1激酶活性定量檢測試劑盒購自上海哈靈生物科技有限公司，S1P ELISA測定試劑盒購自上海前塵生物科技有限公司。

1.3 雙抗體夾心ELISA法檢測S1P的表達

取子宮內膜癌和正常子宮組織，加入10倍預冷的裂解液，在電動組織勻漿機冰上勻漿30s，以12 000r／min離心30min，取上清即為組織勻漿液。取100μL組織勻漿液或血漿加入預先用S1P抗體包被的酶標板中，37℃孵育90min，然后吸出培養(yǎng)基，加入S1P抗體繼續(xù)孵育60min，經(jīng)TBS漂洗3次，加入生物素標記的二抗，反應30min，采用TMB法顯色，經(jīng)終止液終止反應后，用酶標儀（λ＝450nm）記錄各孔的吸光度（A）。取3孔標準化處理后的A值平均數(shù)，按標準曲線計算S1P的表達（單位：pmol／mL）。

1.4 Western blot法檢測SphK1的表達

取子宮內膜癌和正常子宮組織，加入10倍預冷的裂解液，在電動組織勻漿機冰上勻漿30s，以12 000r／min離心30min，取上清，采用二喹啉甲酸（BCA）法進行蛋白定量。總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分離后，轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h，隨后加入SphK1抗體（1∶2 000）4℃過夜，用TBST洗3次，每次10min，用辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫孵育1.5h，TBST（Tris－Buffered Saline with Tween Solution）洗10min，3次，將PVDF膜用發(fā)光試劑增強化學發(fā)光（ECL）顯色，暗室曝光到X光片上，用ImageJ 1.41o軟件進行半定量分析。

1.5 SphK1酶活性的測定

取子宮內膜癌和正常子宮組織，依照產(chǎn)品說明書準備好待測樣品后，取緩沖液到新的酶標板中，依次加入酶促液、反應液、底物液，放進37℃培養(yǎng)箱里靜置3min，加入5μL待測樣品，上下傾倒數(shù)次，混勻后即刻放進酶標儀檢測，樣品SphK1酶活性讀數(shù)為：λ＝340nm 讀數(shù)0min－λ＝340nm 讀數(shù)5min（單位：pmol S1Pmin／mg蛋白質）。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較采用兩樣本t檢驗，計數(shù)資料以率表示，兩組比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 S1P在子宮內膜癌患者血漿和子宮內膜的表達

與正常對照組比較，子宮內膜癌患者血漿S1P的水平顯著升高（P＜0.01）；與正常子宮內膜組織比較，S1P在子宮內膜癌的表達明顯增加（約為1.7倍）（P＜0.01）（見圖1A和1B）。

2.2 子宮內膜癌和正常子宮內膜SphK1表達和酶活性的比較

與正常子宮內膜組織比較，SphK1在子宮內膜癌的表達顯著上調（P＜0.01）（圖2A和2B）。采用組織SphK1激酶活性定量檢測試劑盒測定子宮內膜癌和正常子宮內膜SphK1酶活性，子宮內膜癌SphK1酶活性約是正常子宮組織的2.6倍（P＜0.01）（見圖2C）。

3 討論

S1P是細胞膜磷脂的代謝產(chǎn)物，可作為細胞內信號轉導的第二信使，也可通過細胞表面的S1P受體發(fā)揮生物學作用，參與調節(jié)細胞的增殖、分化、遷移和凋亡等，還可介導血管生成、炎癥反應等生理病理過程。S1P由SphK1磷酸化鞘氨醇生成，而SphK1／S1P信號通路在肝癌、大腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。研究結果［3－5］提示，SphK1是一種癌基因，主要存在于細胞漿中，其表達與乳腺癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、腎癌和直腸癌等腫瘤的惡性程度以及預后相關，可作為腫瘤惡性程度分級的一個指標。然而，目前有關SphK1／S1P信號通路在子宮內膜癌發(fā)病中的作用少見報道。

以往研究［5－8］證實，腫瘤細胞神經(jīng)酰胺和 S1P共同控制細胞的存活或凋亡，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉移浸潤有重要作用。本研究結果顯示，與正常對照組相比，子宮內膜癌患者血漿S1P的水平顯著升高（P＜0.01），S1P在子宮內膜癌的表達明顯增加（約為1.7倍）（P＜0.01）。該結果提示，子宮內膜癌可能發(fā)生鞘脂代謝紊亂和SphK1／S1P信號通路異常，S1P表達升高可能是子宮內膜癌發(fā)生和惡化進展的重要機制之一。當然，沒有測定神經(jīng)酰胺來反映鞘脂代謝是本文的局限性，而S1P在子宮內膜癌發(fā)病中的作用及機制有待進一步研究。

圖1 S1P在子宮內膜癌患者血漿和子宮的表達

圖2 子宮內膜癌患者子宮內膜SphK1的表達和酶活性

新近體內外研究［9，10］證實，SphK1酶的表達與活性可以作為多種惡性腫瘤惡性程度和預后的檢測指標之一，抑制SphK1酶可以促進腫瘤細胞凋亡，提高化療藥物的敏感性。本文進一步的研究結果顯示，子宮內膜癌SphK1酶活性約是正常子宮組織的2.6倍，提示子宮內膜癌患者S1P水平升高的原因可能是SphK1酶被顯著激活，SphK1／S1P信號通路的激活可能是子宮內膜癌的重要發(fā)病機制之一，抑制該通路有可能作為治療子宮內膜癌的靶標。總之，本研究表明子宮內膜癌患者子宮內膜局部SphK1／S1P信號通路被激活，阻斷該通路有可能延緩子宮內膜癌的惡性進展。因此，深入研究SphK1／S1P信號通路在子宮內膜癌發(fā)病中的詳細作用及分子機制，以及與子宮內膜癌惡性程度和預后的關系，都將有助于闡明子宮內膜癌的發(fā)病機制和拓展新的防治策略。

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