環(huán)腺苷酸擬似物 8-CPT-cAMP誘導骨髓瘤細胞凋亡的實驗研究

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院血液內(nèi)科，上海 200011

環(huán)腺苷酸擬似物 8-CPT-cAMP誘導骨髓瘤細胞凋亡的實驗研究

杭海芳 王瑩瑩 朱琦

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院血液內(nèi)科，上海 200011

朱琦，醫(yī)學博士，主任醫(yī)師，碩士生導師?，F(xiàn)任上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院血液科主任，中華醫(yī)學會上海分會血液學專科委員會委員，上海市中西醫(yī)結(jié)合血液病專業(yè)委員會常務委員，上海血液學研究所副所長。2003年赴新加坡中央醫(yī)院血液病治療中心擔任外籍醫(yī)師，在血液病，尤其是惡性血液病的診斷和治療方面具有較豐富的臨床經(jīng)驗。曾先后主持上海市科委自然基金、上海市衛(wèi)生局基金和高等學校青年科學基金等課題多項，并作為主要參與者參加多項國家自然科學基金面上項目。先后獲上海市政府頒發(fā)的自然科學一等獎、上海市醫(yī)學科技獎一等獎、中華人民共和國教育部自然科學獎一等獎和中華醫(yī)學一等獎等獎項。迄今為止已在國內(nèi)外核心期刊以第一作者或通信作者發(fā)表論文40余篇，其中SCI收錄6篇，參編血液病專著3部。

背景與目的：多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者經(jīng)標準方案治療后緩解率雖高，但其緩解后復發(fā)及對化療藥物耐藥性的產(chǎn)生較普遍。通過調(diào)變細胞內(nèi)環(huán)腺苷酸濃度可以誘導多種腫瘤細胞增殖阻滯和凋亡，成為腫瘤治療新途徑。本研究觀察環(huán)腺苷酸擬似物8-對氯苯硫基環(huán)腺苷酸［8-(4-chlorophenylthio) adenosine 3’，5’-cyclic monophosphate，8-CPT-cAMP］對MM細胞生物學行為的影響，探討其誘導MM細胞凋亡的可能機制，為開發(fā)臨床MM治療新藥提供研究方向。方法：以不同濃度8-CPT-cAMP處理MM細胞系U266，用細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)檢測其增殖，流式細胞儀檢測細胞周期、凋亡率和線粒體跨膜電位的變化，實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)分別檢測凋亡相關基因caspase-8、caspase-9、Bcl-2和Bax的轉(zhuǎn)錄及Bcl-2、Bax蛋白的表達。結(jié)果：U266細胞經(jīng)不同濃度8-CPT-cAMP處理5 d后，生長受到明顯抑制，呈濃度和時間依賴性；伴隨作用時間延長，8-CPT-cAMP的半數(shù)有效抑制濃度(IC50)明顯減低，第5天可達58.52 μmol/L。U266細胞周期在8-CPT-cAMP濃度增加的狀態(tài)下逐漸停滯在G0/G1期；各濃度組細胞增殖抑制率、凋亡率與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同時8-CPT-cAMP能夠誘導U266細胞線粒體跨膜電位下降；此外，經(jīng)8-CPT-cAMP處理48和72 h后，不同濃度U266細胞Bcl-2 mRNA及蛋白表達較對照組明顯下降(P＜0.05)，caspase-9、Bax mRNA及 Bax蛋白表達明顯升高(P＜0.05)，而caspase-8 mRNA表達與對照組比較無明顯差異。結(jié)論：8-CPT-cAMP能夠抑制骨髓瘤細胞增殖并誘導其凋亡，呈時間和濃度依賴性；該效應可能通過caspase依賴的線粒體誘導細胞凋亡途徑來實現(xiàn)。

環(huán)腺苷酸；骨髓瘤；細胞凋亡

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是漿細胞克隆增殖性疾病，為常見血液系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于非霍奇金淋巴瘤。隨著早期診斷及治療手段的提高，MM患者臨床緩解率和生存時間較以往有明顯改善，但其緩解后復發(fā)及對化療藥物耐藥性的產(chǎn)生仍較普遍［1］。因此，尋找骨髓瘤新型藥物靶標對改善MM患者預后至關重要。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)衍生物對多種腫瘤細胞具有促凋亡作用，是一類極具臨床價值的細胞凋亡誘導劑［2-3］。鑒于此，本研究以骨髓瘤細胞系U266為體外模型，探討cAMP擬似物8-對氯苯硫基環(huán)腺苷酸［8-(4-chlorophenylthio) adenosine 3’，5’-cyclic monophosphate，8-CPT-cAMP］對U266細胞的促凋亡效應及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)和形態(tài)學觀察

MM細胞株U266由上海交通大學醫(yī)學院病理與病理生理學教研室提供。將2×105個/mL的U266細胞接種于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素和2 mmol/mL谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液(美國Sigma公司)中，常規(guī)條件下培養(yǎng)(37 ℃，CO2體積分數(shù)為5%，95%濕度)48 h后抽取部分細胞進行細胞涂片儀(Shandon)涂片，瑞士藍染色，光鏡下觀察其細胞形態(tài)，并以Image-Pro Plus軟件拍攝圖像。

1.2 細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)法檢測細胞增殖抑制率

取對數(shù)生長期的U266細胞，按2×105個/mL密度接種于96孔板，每孔100 μL。實驗組分別加入終濃度為100、200、300和400 μmol/L的8-CPT-cAMP(美國Santa Cruz公司)，同時設溶劑對照組(加入含0.1% DMSO的無血清IMDM培養(yǎng)基)和空白對照組，每組3個復孔。置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%飽和濕度培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48、72、96及120 h后每孔分別加入10 μL CCK-8溶液(同仁化學研究所，日本)，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標儀振蕩，以空白對照孔調(diào)零，測450 nm處各孔吸光度(A)值。按公式：細胞增殖抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100% 進行計算。

1.3 流式細胞儀檢測細胞周期、凋亡率和線粒體跨膜電位

1.3.1 細胞周期檢測

分別收集上述不同濃度處理的細胞，PBS洗滌后加入75%乙醇，-20 ℃固定過夜；加入1×PBS 10 mL混勻，2 500 r/min離心5 min，離心半徑8.5 cm，洗滌2次，分別加入100 mg/mL Rnase 37 ℃溫育30 min；采用100 μg/mL碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色后行流式細胞儀檢測。所有數(shù)據(jù)由Beckman Couler公司的Multicycle軟件收集、存儲和分析。

1.3.2 細胞凋亡率檢測

根據(jù)Annexin-Ⅴ/FITC凋亡檢測試劑盒(BD，SanDiego，CA)說明，將不同處理組細胞PBS洗滌后加入1 mL結(jié)合緩沖液，漂洗細胞1次。依次加入100 μL結(jié)合緩沖液及3 μL Annexin-Ⅴ/ FITC，重懸混勻，避光溫育15 min，再加入3 μL PI，避光溫育3 min；每管加入結(jié)合緩沖液350 μL，1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。

1.3.3 線粒體跨膜電位檢測

將對照及各組U266細胞以1 mL培養(yǎng)液重懸。按照線粒體凋亡檢測試劑盒(Biovision)說明，分別加入10 μg/mL線粒體凋亡檢測試劑羅丹明(Rh123)，并于37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中溫育30 min，2 500 r/min離心5min，離心半徑8.5cm，去除上清液，PBS洗滌1次。以250 μg/mL PI染色，流式細胞儀檢測，Rh123/PI熒光強度即為線粒體跨膜電位。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RTPCR)檢測細胞凋亡相關基因mRNA表達

以4×105個/mL密度接種U266細胞于6孔板。實驗組加入200 μmol/L 8-CPT-cAMP，對照組加入0.5%DMSO，每孔設復孔2個；置37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后收集細胞，抽提細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄，進行PCR擴增；PCR循環(huán)參數(shù)為：95 ℃變性5 s，60 ℃退火，延伸40 s，共40個循環(huán)。檢測細胞caspase-8、caspase-9、Bcl-2和Bax基因的表達(各基因上下游引物見表1)，△Ct=Ct各組的值-CtGAPDH值，以2-△△Ct方法計算基因表達量。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測細胞凋亡相關蛋白表達

在PBS洗滌后的各組 U266細胞中加入細胞裂解液提取總蛋白，經(jīng)考馬斯亮藍定量后，取各組等量總蛋白進行8%～15%SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)膜；膜經(jīng)10%脫脂奶粉(含0.1% Tween-20)室溫封閉1 h，加入相應一抗(包括Bcl-2和Bax)，4 ℃過夜；經(jīng)含0.1% Tween-20的PBS充分洗滌后與相應稀釋度的二抗室溫反應30 min，依據(jù)ECL試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，England)顯色掃描保存。所用抗體均購自Santa Cruz公司。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 11.0軟件包進行統(tǒng)計分析，成組設計t檢驗法比較各組間差異。結(jié)果以表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 RT-PCR引物序列Tab. 1 Primer sequences of RT-PCR

2 結(jié) 果

2.1 8-CPT-cAMP對U266細胞增殖的影響

骨髓瘤細胞株U266經(jīng)不同濃度(100、200、300和400 μmol/L)8-CPT-cAMP處理5 d后，細胞生長受到明顯抑制，活力也有明顯變化，且呈濃度和時間依賴性。400 μmol/L 8-CPT-cAMP處理U266第5天，U266細胞幾乎全部凋亡；且伴隨作用時間延長，8-CPT-cAMP的半數(shù)有效抑制濃度(IC50)呈明顯減低趨勢。各組細胞抑制率與對照組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表2)。

2.2 8-CPT-cAMP對U266細胞周期、凋亡率及線粒體跨膜電位凋亡的影響

采用不同濃度8-CPT-cAMP(100、200、300和400 μmol/L)處理U266細胞72 h。結(jié)果如表3所示：隨著藥物濃度的增加，U266細胞G0/ G1期細胞逐漸增多，而G2/M期及S期細胞逐漸減少，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。進一步以Annexin-Ⅴ/PI雙染法比較各實驗組與對照組細胞凋亡率，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Rh123是一種親脂性陽離子熒光染料，可發(fā)射綠色熒光被線粒體吸收，其吸收量與△Ψm呈正比。U266經(jīng)PI和Rh123雙染后分為PI-Rh123high、PI-Rh123low和PI+Rh123low共3個亞群，分別代表正常細胞(△Ψm正常，膜完整)、凋亡細胞(△Ψm崩潰，膜尚完整)和死亡細胞(△Ψm崩潰，膜破壞)。經(jīng)不同濃度8-CPT-cAMP處理的U266細胞，PI-Rh123low染色相比對照組均明顯增強(P＜0.05)，且有明顯濃度依賴性。

2.3 8-CPT-cAMP對U266細胞內(nèi)凋亡調(diào)控因子mRNA表達的影響

不同濃度U266細胞分別經(jīng)8-CPT-cAMP處理48和72 h后，Bcl-2 mRNA表達量較溶劑對照組明顯下降(P＜0.05)，caspase-9及Bax mRNA表達較溶劑對照組升高(P＜0.05)，而caspase-8 mRNA表達與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表4) 。

2.4 8-CPT-cAMP對U266細胞內(nèi)凋亡調(diào)控因子蛋白表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，相比溶劑對照組，不同濃度8-CPT-cAMP(200、300和400 μmol/L)處理U266細胞 72 h 后，Bcl-2表達水平顯著下調(diào)，而Bax表達則逐漸增強(圖1)。

表2 8-CPT-cAMP作用5 d后U266細胞增值活性的影響Tab. 2 Effect of 8-CPT-cAMP on the survival of myeloma cell lines

表3 8-CPT-cAMP對U266細胞周期、凋亡率及線粒體跨膜電位凋亡的影響Tab. 3 Sensitivity of MM cell lines to 8-CPT-cAMP

表4 8-CPT-cAMP對U266細胞基因表達水平的影響Tab. 4 Reactivation of gene expression by 8-CPT-cAMP treatment in myeloma cell lines U266

圖1 不同濃度8-CPT-cAMP對U266細胞Bcl-2及Bax蛋白表達的影響Fig. 1 The expression of Bax and Bcl-2 protein was tested by Western blot with 8-CPT-cAMP

3 討 論

cAMP作為信號轉(zhuǎn)導最普遍的第二信使，參與體內(nèi)多種造血調(diào)控因子對造血細胞增殖、分化和凋亡的調(diào)節(jié)。相對正常組織細胞，腫瘤細胞內(nèi)cAMP信號通路存在異常變化［4］，因而，調(diào)變細胞內(nèi)cAMP信號表達可能成為腫瘤治療的新途徑。

近來研究顯示，磷酸二酯酶抑制劑等藥物可通過增高細胞內(nèi)cAMP濃度，誘導惡性淋巴細胞凋亡［5］，提示cAMP表達與腫瘤細胞生長密切相關。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，cAMP擬似物8-氯-cAMP能夠誘導骨髓瘤細胞增殖阻滯和凋亡［6］，但8-氯-cAMP可能通過其代謝物8-氯-腺苷產(chǎn)生細胞毒作用而非由cAMP信號通路介導。鑒于此，本研究采用能滲入胞膜且不易降解的cAMP擬似物8-CPT-cAMP處理骨髓瘤細胞，觀察提高骨髓瘤細胞內(nèi)cAMP水平對其生物學行為的影響。結(jié)果顯示，8-CPT-cAMP可阻滯骨髓瘤U266細胞增殖，且絕大多數(shù)細胞停滯在G0/G1期，并呈劑量依賴性。同時，經(jīng)8-CPT-cAMP處理72 h后的U266細胞形態(tài)呈現(xiàn)核固縮和凋亡小體等典型凋亡表現(xiàn)，經(jīng)流式細胞儀檢測，細胞發(fā)生凋亡。

增殖優(yōu)勢和凋亡受阻是骨髓瘤細胞重要生物學特性。經(jīng)典細胞凋亡主要包括線粒體途徑和死亡受體途徑［7］。本實驗發(fā)現(xiàn)，8-CPT-cAMP可誘導U266細胞線粒體跨膜電位，并呈劑量依賴性，提示8-CPT-cAMP誘導U266細胞凋亡可能是通過細胞內(nèi)線粒體途徑。其次，定量PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，8-CPT-cAMP處理后的U266細胞內(nèi)Bcl-2抗凋亡因子轉(zhuǎn)錄和表達水平顯著降低，而Bax促凋亡因子轉(zhuǎn)錄和表達明顯升高，提示8-CPT-cAMP可能通過上調(diào)Bax，同時下調(diào)Bcl-2來介導U266細胞凋亡。但其具體作用機制有待進一步研究。

綜上所述，8-CPT-cAMP能夠抑制U266細胞增殖，促使細胞凋亡。鑒于8-CPT-cAMP主要通過提高細胞內(nèi)cAMP水平而發(fā)揮作用，故針對性設計調(diào)變骨髓瘤細胞內(nèi)cAMP信號表達的藥物，可成為骨髓瘤誘導凋亡治療的新途徑。

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Experimental study on cAMP analogue 8-CPT-cAMP inducing apoptosis in multiple myeloma cells

HANG Hai-fang, WANG Ying-ying, ZHU Qi
(Department of Hematology, Shanghai Ninth People’s

Hospital Af fi liated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China)

ZHU Qi E-mail: zhuqi70@hotmail.com

Background and purpose: Despite the high remission rate in patients with multiple myeloma (MM) after the standard regimen, but often relapsed and resistant. It has been shown that modulation of cAMP can induce cell cycle arrest and apoptosis in a variety of tumor cells, which has become an interesting approach to cancer therapy. This study aimed to investigate possible effects of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) analogue 8-(4-chlorophenylthio) adenosine 3’, 5’-cyclic monophosphate (8-CPT-cAMP) on multiple myeloma cells, provide direction to develop new drugs for the treatment of MM. Methods: The myeloma cell line U266 cells were treated with 8-CPT-cAMP of different concentrations. The proliferation of U266 cells was evaluated through cell counting kit (CCK-8) assay, fl ow cytometry was used to analyze the changes of cell were distribution, apoptosis rate as well as mitochondrial transmembrane potential (ΔΨm) in U266 cells before and after the treatment. Meanwhile, real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot assay were used to detect expression levels of apoptosis regulators including caspase-8, caspase-9, Bcl-2 and Bax genes in U266 cells before and after the treatment. Results: The U266 cells were treated 5 days with 8-CPT-cAMP of different concentration, it was shown that 8-CPT-cAMP could signi fi cantly inhibit cell growth of U266 cells in a concentration and time dependent manner, the IC50of 8-CPT-cAMP was reduced obvious prolonged reaction time, and reached to 58.52 μmol/L in the fi fth day. The cell cycle of U266 cells was stopped in G0/ G1stage as the progress of concentration. It was showed statistical signi fi cant difference associated with the cellular proliferation inhibition rate and apoptosis rate in different concentration and control (P＜0.05). Meanwhile, 8-CPT-cAMP could induce mitochondrial transmembrane potential collapse in U266 cells. Compared with control groups, the levels of Bcl-2 mRNA transcripts and protein in U266 cells were reduced in 8-CPT-cAMP treated groups (P＜0.05), while the levels of caspase-9, Bax mRNA transcription and the expression of Bax protein were increased in treatment groups, but the caspase-8 mRNA had no statistical signi fi cant difference with controls. Conclusion: 8-CPT-cAMP can inhibit the proliferation and promote apoptosis of myeloma cells, which might be mediated by caspase via mitochondrial pathway.

cAMP; Myeloma; Cell apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.10.007

R733.3

A

1007-3639(2014)10-0755-06

2014-07-12）

上海市自然科學基金資助項目(No:12ZR1416800)。

朱琦 E-mail:zhuqi70@hotmail.com