外界刺激對(duì)內(nèi)源性生長(zhǎng)因子TGF-β1的影響

顧令婉 周 莉 張 睿 李昱良 王 凱*

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，貴州 遵義 563003）

外界刺激對(duì)內(nèi)源性生長(zhǎng)因子TGF-β1的影響

顧令婉 周 莉 張 睿 李昱良 王 凱*

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，貴州 遵義 563003）

目的 觀察備洞對(duì)家犬牙髓中TGF-β1表達(dá)的影響及修復(fù)性牙本質(zhì)的形成情況，探討牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體原位形成和內(nèi)源性生長(zhǎng)因子的相關(guān)性。方法 6只健康家犬，分別選取四顆磨牙，隨機(jī)分為1、2、3、4四個(gè)組，每組6顆牙；1組不予任何處理，作為對(duì)照組，2、3、4組為實(shí)驗(yàn)組，分別給予長(zhǎng)3 mm，寬3 mm，洞深2、2.5、3 mm的備洞刺激，予氧化鋅丁香油粘固劑暫封窩洞，分別于2、4、6 周麻醉下拔除，制作病理切片，顯微鏡下觀察修復(fù)性牙本質(zhì)的形成情況，圖像分析和免疫組化方法觀察轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的表達(dá)。結(jié)果 在2.5 mm洞深刺激強(qiáng)度下，2 周時(shí)，每組都沒(méi)有修復(fù)性牙本質(zhì)形成；3 mm洞深刺激強(qiáng)度，4、6周時(shí)，前期牙本質(zhì)增寬，成牙本質(zhì)細(xì)胞空泡變性，有第三期牙本質(zhì)形成；每組都有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1表達(dá)，結(jié)果表明：隨著刺激度強(qiáng)和時(shí)間增加，呈表達(dá)增強(qiáng)趨勢(shì)（P＜0.05）。結(jié)論 備洞刺激可能激活了內(nèi)源性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1，且可能參與了牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體的形成，內(nèi)源性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的誘導(dǎo)表達(dá)與時(shí)間和刺激強(qiáng)度成正相關(guān)關(guān)系。

修復(fù)性牙本質(zhì)；牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體構(gòu)成了牙齒的主體，是高度特化的組織器官。窩洞制備、牙體預(yù)備、損傷、炎癥、齲蝕等外界刺激因素均可給牙髓健康造成危害，誘導(dǎo)和加強(qiáng)牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體的原位形成，保護(hù)牙髓健康是牙髓生物學(xué)近年研究的熱點(diǎn)。本文觀察了家犬牙齒在不同強(qiáng)度刺激下，內(nèi)源性生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1在牙髓中的表達(dá)情況和第三期牙本質(zhì)形成情況，對(duì)內(nèi)源性生長(zhǎng)因子與牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體形成的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行探討，期望為研究牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體的誘導(dǎo)形成提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

12～24個(gè)月齡家犬，每只分別選取四顆磨牙為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，要求無(wú)明顯磨耗、牙周、牙體健康。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

二步法免疫組化檢測(cè)試劑（批號(hào)：K106629B）、濃縮型DAB試劑盒（批號(hào)：753223A）、TGF-β1兔抗體（Santa Cruz Biotechonlogy，Inc批號(hào)：K0410）（均購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)公司）；高速渦輪機(jī)、光學(xué)顯微鏡等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組：6只家犬，每只分別選取四顆磨牙，隨機(jī)分為1、2、3、4四組，每組6顆牙；1組不作任何處理，作為對(duì)照組；2、3、4組作為實(shí)驗(yàn)組，3%戊巴比妥鈉1 mL/kg經(jīng)腹腔注射麻醉下，分別制備長(zhǎng)3 mm，寬3 mm，洞深2、2.5、3 mm的窩洞，為外界刺激方式，立即給予丁氧膏封閉窩洞。為防止丁氧膏脫落，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均為軟食喂養(yǎng)。

1.3.2 標(biāo)本采集和處理：各組在完成實(shí)驗(yàn)后第2、4、6周，3%戊巴比妥鈉1 mL/kg經(jīng)腹腔注射麻醉下拔出實(shí)驗(yàn)牙，每次2只，10%中性甲醛鹽溶液固定標(biāo)本72 h，沿長(zhǎng)軸將牙劈開(kāi)，將牙髓組織完整取出，用5%硝酸浸泡牙體硬組織脫鈣至軟，常規(guī)制備組織切片，硬組織切片作HE染色，軟組織切片作免疫組化染色。

1.3.3 結(jié)果觀察及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：牙體硬組織中修復(fù)性牙本質(zhì)的形成在光學(xué)顯微鏡下觀察；通過(guò)Image-Pro Plus 6.0計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析免疫組化染色結(jié)果，陽(yáng)性信號(hào)為胞質(zhì)和包膜出現(xiàn)黃色著色，棕黃色為強(qiáng)陽(yáng)性，黃色為陽(yáng)性，淺黃色為弱陽(yáng)性，未染色為陰性。在免疫組化照片上按相同面積截取對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞層進(jìn)行光密度值分析，黃色部分的IOD值表示該蛋白的表達(dá)水平，數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均用（）表示。采用單因素方差分析對(duì)多組之間進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果

在2.5 mm制洞強(qiáng)度刺激下，2周時(shí)，每組都無(wú)修復(fù)性牙本質(zhì)形成，在3 mm 制洞強(qiáng)度刺激下，4、6周時(shí)，有修復(fù)性牙本質(zhì)形成，前期牙本質(zhì)增寬，成牙本質(zhì)細(xì)胞呈空泡變性，修復(fù)性牙本質(zhì)與原發(fā)性牙本質(zhì)之間有深色分隔條帶（圖1、2、3）。

2.2 免疫組化染色結(jié)果

2.2.1 鏡下觀察結(jié)果：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1在各組牙髓組織中均有表達(dá)，1組和2組成牙本質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)和包膜染色呈淺黃色，表達(dá)呈弱陽(yáng)性；3組和4組成牙本質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)和包膜染色呈黃色，表達(dá)呈陽(yáng)性，其中4組在4周后染色呈棕黃色，表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性；隨時(shí)間和刺激強(qiáng)度增加，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1表達(dá)逐漸增強(qiáng)（圖4、5）。

2.2.2 圖像分析結(jié)果：不同刺激強(qiáng)度和不同時(shí)間組經(jīng)圖像分析和比較:1、2組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的表達(dá)差異無(wú)顯著性（P＞0.05）；1、3組，1、4組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1表達(dá)差異有顯著性（P＜0.05）；2、3、4組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的表達(dá)有顯著性差異（P＜0.05）。

3 討 論

牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體的原位形成包括了反應(yīng)性牙本質(zhì)和修復(fù)性牙本質(zhì)。修復(fù)性牙本質(zhì)也叫刺激性牙本質(zhì)，是在比較強(qiáng)的刺激下形成的，特點(diǎn)是有管間牙本質(zhì)的形成，牙本質(zhì)小管數(shù)目減少。備洞等外界因素導(dǎo)致牙本質(zhì)暴露及成牙本質(zhì)細(xì)胞發(fā)生變性，由年輕成纖維細(xì)胞分化而來(lái)的成牙本質(zhì)細(xì)胞或鄰近的成牙本質(zhì)細(xì)胞代替變性細(xì)胞在損害區(qū)形成牙本質(zhì)，使得牙髓組織得以保護(hù)，免受不良刺激[1]。

圖1 2周2.5 mm HE×40

圖2 4周3 mm HE×40

圖3 6周3 mm HE×40

圖4 2周對(duì)照 HE×40

圖5 2周2mm HE×40

研究表明：刺激性牙本質(zhì)的形成依靠前體細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，而成牙本質(zhì)細(xì)胞的合成和分泌活性增強(qiáng)有利于反應(yīng)性牙本質(zhì)的形成，因此，成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化和增殖是牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體形成的重要環(huán)節(jié)。TGF-β在多種組織細(xì)胞的分化增殖、組織損傷修復(fù)、骨質(zhì)再實(shí)驗(yàn)雖然觀察到TGF-β1的表達(dá)隨時(shí)間和刺激強(qiáng)度的增加而增加，修復(fù)性牙本質(zhì)的形成也與時(shí)間和刺激強(qiáng)度有關(guān)，但TGF-β1的表達(dá)在促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成的機(jī)制還不清楚；同時(shí)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體能夠承受刺激的最大閾值未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，當(dāng)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體失去修復(fù)能力時(shí)能否通過(guò)誘導(dǎo)TGF-β1的表達(dá)而增強(qiáng)其修復(fù)能力仍然需要進(jìn)一步探索。

[1] 樊明文,周學(xué)東.牙體牙髓病學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2008.

[2] Smith AJ,Cassidy N,Perry H,et al.Reactionary dentinogenesis[J]. Int J Dev Biol,1995,39(1):273-280.

[3] Tziafas D,Papadimitriou S.Role of exogenous TGF-β in inductin of reparative denntinogenesis in vivo[J].Eur J Oral Sci,1998,106 (Suppl l):192.

[4] Smith AJ,Cassidy N,Perry H,et al.Reactionary dentinogenesis[J]. Int J Dev Biol,1995,39(1):273-280.

[5] 張倩,程祥榮,何俐,等.全冠牙體預(yù)備后影響牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體反應(yīng)因素的研究[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào),2005,26(3):355-358.生、間質(zhì)形成，以及胚胎發(fā)育中起著重要作用[2]。不僅對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞層的生物合成活性有增強(qiáng)刺激的效應(yīng)，而且可使牙髓細(xì)胞發(fā)生增殖分化和遷移，對(duì)牙髓成纖維細(xì)胞具有強(qiáng)趨化作用。攜帶主要信息參與成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化，參與間充質(zhì)與上皮間的信號(hào)傳遞，作為一種信號(hào)分子可能參與了成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化啟動(dòng)過(guò)程[3,4]。

實(shí)驗(yàn)采用的外界刺激因素為制備窩洞，觀察了不同深度的制洞刺激下，內(nèi)源性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1在牙髓組織中的表達(dá)水平和刺激性牙本質(zhì)形成情況，結(jié)果表明：2.5 mm刺激強(qiáng)度下，2周以前，每組都沒(méi)有修復(fù)性牙本質(zhì)形成，3 mm刺激強(qiáng)度下，4、6周時(shí)，有修復(fù)性牙本質(zhì)形成前期牙本質(zhì)增寬，成牙本質(zhì)細(xì)胞發(fā)生空泡變性，修復(fù)性牙本質(zhì)與原發(fā)性牙本質(zhì)之間有深色分隔條帶；各組牙髓組織中均有TGF-β1表達(dá)，且表達(dá)水平隨刺激強(qiáng)度和時(shí)間呈增強(qiáng)趨勢(shì)。但當(dāng)刺激時(shí)間和刺激強(qiáng)度達(dá)到一定的程度，牙髓組織的修復(fù)能力不足以承受時(shí)，牙髓組織可能出現(xiàn)炎性反應(yīng)，甚至牙髓壞死。張倩[5]等研究認(rèn)為：當(dāng)剩余牙本質(zhì)厚度＜2.5 mm時(shí)，隨著時(shí)間的增加，牙髓即可產(chǎn)生防御反應(yīng)，6周左右能觀察到刺激性牙本質(zhì)形成，故本實(shí)驗(yàn)觀察的最長(zhǎng)時(shí)間為6周。

R78

：B

：1671-8194（2014）05-0055-02

貴州省衛(wèi)生廳青年科技基金項(xiàng)目

*通訊作者：E-mail:297756834@qq.com