自體DC—CIK細(xì)胞聯(lián)合替吉奧治療中晚期肝癌的療效觀察

梁倩影　劉先領(lǐng)

【摘要】目的：觀察中晚期肝癌患者行自體DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合替吉奧治療的臨床療效及不良反應(yīng)。方法 采集48例中晚期原發(fā)性肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入細(xì)胞因子定向誘導(dǎo)DC及CIK，8d后將擴(kuò)增的DC及CIK細(xì)胞以靜脈回輸?shù)姆绞?，?duì)患者進(jìn)行自體DC-CIK細(xì)胞輸注治療，同時(shí)聯(lián)合口服替吉奧治療。結(jié)果 自體DC-CIK聯(lián)合替吉奧治療12周后CR0例PR10例，SD22例，PD16例，總有效率（RR）為20.8%，疾病控制率（DCR）為66.7%。患者免疫功能提高，生活質(zhì)量改善。結(jié)論 自體免疫細(xì)胞聯(lián)合替吉奧治療中晚期肝癌療效尚可，副作用小，安全性好。

【關(guān)鍵詞】樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）；替吉奧；肝癌；

【中圖分類號(hào)】R9145 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2014）04-0150-02

原發(fā)性肝癌是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率逐年上升，已超過(guò)62.6萬(wàn)/年，而我國(guó)占全球總數(shù)的55%，每年約有30萬(wàn)人死于肝癌，在腫瘤相關(guān)死亡中位居第二為，僅次于肺癌[1]。盡管外科手術(shù)水平和肝癌移植技術(shù)已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步，但由于肝癌起病隱匿，侵襲生長(zhǎng)迅速，80%以上的肝癌患者在確診時(shí)已存在肝癌播散、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、門脈癌栓或伴有嚴(yán)重的肝硬化，不能進(jìn)行手術(shù)，甚至是介入、微波等治療均存在限制，包括全身化療在內(nèi)的非手術(shù)療法仍不失為延長(zhǎng)生存、提高生活質(zhì)量的重要方法。隨著替吉奧、卡培他濱等新型化學(xué)治療藥物的問(wèn)世，口服單藥化療逐漸成為臨床上采用的姑息性治療方法[2]。腫瘤生物免疫治療做為一種新興的治療手段成為近年來(lái)腫瘤治療領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cells DC）是目前已知體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（Cytokine-induced killer cells CIK）是一種在體外經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)、增殖而得的具有抗瘤譜廣、殺瘤活性高的特性的免疫活性細(xì)胞。為此，本研究采用DC-CIK自體免疫細(xì)胞聯(lián)合替吉奧治療48例中晚期肝癌患者，取得一定療效，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料

1.1.1 入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)影像學(xué)或病理活檢確診的中晚期肝癌患者，無(wú)法行手術(shù)治療，不適合或不考慮行肝動(dòng)脈栓塞化療者；（2）患者自愿接受上述治療并簽署同意書(shū)；（3）肝功能Child-Pugh分級(jí)為A或B患者；（4）各項(xiàng)常規(guī)、生化檢查指標(biāo)無(wú)相關(guān)禁忌癥；（5）Kamofsky評(píng)分≥60，無(wú)嚴(yán)重的心、肺、腎功能障礙及全身惡液質(zhì)情況；（6）預(yù)計(jì)生存期大于3個(gè)月；（7）無(wú)明顯感染，無(wú)精神類疾病。

1.1.2 研究對(duì)象：我科2011年1月-2013年5月經(jīng)檢查確診為中晚期肝癌的患者48例，其中男34例，女14例，年齡31-72歲，平均年齡48.6歲，經(jīng)影像學(xué)或病理活檢確診但無(wú)法行手術(shù)治療，不適合或不同意行肝動(dòng)脈栓塞化療者。巨塊型肝癌26例，多發(fā)結(jié)節(jié)型肝癌22例，其中外科手術(shù)失敗或術(shù)后復(fù)發(fā)患者占9例?；颊吒蝺?nèi)病灶大小在2×3cm-13.0×15.1cm之間，含肝硬化、門靜脈及下腔靜脈癌栓、腹腔積液、黃疸、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。28例病例有原發(fā)病或/和轉(zhuǎn)移瘤的病理學(xué)或組織細(xì)胞學(xué)證據(jù)，所有病例均有相應(yīng)的影像學(xué)資料，有可見(jiàn)原發(fā)灶或/和轉(zhuǎn)移病灶可供評(píng)估療效。

1.2 治療方法

所有入組病例均先行外周血單核細(xì)胞采集，標(biāo)本送實(shí)驗(yàn)室行DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng)及擴(kuò)增，后開(kāi)始口服替吉奧治療，細(xì)胞培養(yǎng)完成后安排自體DC-CIK細(xì)胞輸注治療。12周為1個(gè)療程，如無(wú)明顯不良反應(yīng)則重復(fù)療程。治療期間每周查血常規(guī)1次，每2周查肝功能1次，白細(xì)胞計(jì)數(shù)<3×109/L或肝功能異常時(shí)停藥2周后進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)藥物反應(yīng)性好及可耐受治療者停藥2-4周后可繼續(xù)治療。

1.2.1 替吉奧（S-l）治療

根據(jù)體表面積來(lái)確定初始劑量，體表面積<1.25m2，S-l 40mg/次，2次/d；體表面積1.25～1.5m2，S-1 50mg/次，2次/d；體表面積>1.5m2，S-l 60mg/次，2次/d，早飯后和晚飯后分別口服1次，連續(xù)服用28 d（4周），停藥14d（2周）。12周為1個(gè)療程。

1.2.2 DC-CIK治療

（1）細(xì)胞分離 經(jīng)CS-3000血細(xì)胞分離機(jī)采集患者外周血5L中的新鮮抗凝外周血單核細(xì)胞，再用聚蔗糖400（Ficoll 400）分離后經(jīng)Hank′s液洗3次，收集純度在90%以上的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMNC）。

（2）CIK體外培養(yǎng)和擴(kuò)增 將PBMNC加入到含1000U/mL IFN-γ和自體血清的完全培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.0×106個(gè)/mL，24h后加入IL-2 1000U/mL和CD3單抗0.5 μg/mL，后根據(jù)CIK生長(zhǎng)情況每隔2d～3d適時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)基和IL-2，置于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d～14d后。每周2次測(cè)定白細(xì)胞增殖率和CD3、CD56陽(yáng)性細(xì)胞率，當(dāng)細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增達(dá)到設(shè)計(jì)目標(biāo)，陽(yáng)性目標(biāo)細(xì)胞達(dá)到85%時(shí)，離心收集細(xì)胞，同時(shí)取樣做質(zhì)量檢控（參照柯萊遜《質(zhì)量檢控標(biāo)準(zhǔn)》CLS-T-W-009）。將合格的CIK分4次靜脈回輸至患者體內(nèi)，單次回輸CIK數(shù)目不少于1.0×109個(gè)。

（3）DC體外培養(yǎng)和擴(kuò)增 將CS-3000分離的到的PBMNC用無(wú)血清1640培養(yǎng)液重懸，濃度為2×106/ml鋪入6孔板，孵育2h后棄上清，獲得貼壁單核細(xì)胞，加入DC完全培養(yǎng)基（含GM-CSF 100ng/mL和IL-4 500U/mL），置于37°、5%CO2培養(yǎng)箱中；培養(yǎng)第5d加入TNF-α誘導(dǎo)DC成熟，第7～8d收集懸浮的DC，同時(shí)取樣做質(zhì)量檢控（參照柯萊遜《質(zhì)量檢控標(biāo)準(zhǔn)》CLS-T-W-009）。將合格的DC分4次靜脈回輸至患者體內(nèi)，單次回輸DC數(shù)目不少于1.0×107個(gè)。

（4）細(xì)胞回輸方案 患者一般狀況良好，細(xì)胞培養(yǎng)成熟后開(kāi)始交替回輸CIK和DC，2～3次/周，一次回輸CIK不少于1×109個(gè)，DC不少于1×107個(gè)。

（5）外周血免疫功能檢測(cè) 細(xì)胞治療前及治療完成4周后檢測(cè)患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群（CD3+、CD4+、CD16+CD56+、CD4+/CD8+）變化。

1.3 觀察及療效評(píng)估

觀察指標(biāo)包括治療前后瘤體變化、外周血免疫指標(biāo)、腫瘤標(biāo)志物、癥狀改變、生活質(zhì)量及不良反應(yīng)等。療效評(píng)估采用美國(guó)癌癥研究所制定的實(shí)體腫瘤RESIST療效評(píng)估方法，將療效分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩(wěn)定（SD）、進(jìn)展（PD），總有效率（RR）=CR+PR，疾病控制率（DCR）=CR+PR+SD[5]。記錄患者治療前后食欲、睡眠、精神、體力等情況，用 Karnofsky 計(jì)分法（見(jiàn)附錄B）判斷治療前及治療后生活質(zhì)量的改善情況，凡在治療后較治療開(kāi)始前計(jì)分提高10分以上者為改善，下降10分以上者為惡化，提高或下降10分者為穩(wěn)定，總提高率=（改善+穩(wěn)定）×100%。不良反應(yīng)按WHO抗腫瘤藥物不良反應(yīng)的分度標(biāo)準(zhǔn)，分為0～Ⅳ度[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘤體變化

48例中晚期肝癌病例均有可測(cè)量病灶，經(jīng)DC-CIK聯(lián)合替吉奧治療1周期（12周）后，采用彩超、CT、MRI等影像學(xué)檢查方法測(cè)量病灶大小，按RESIST實(shí)體瘤的近期療效標(biāo)準(zhǔn)，其中CR 0例，PR 10例，SD 22例，PD 16例，總有效率（RR）為20.8%，疾病控制率（DCR）為66.7%。

2.2 外周血免疫指標(biāo)變化

接受DC-CIK聯(lián)合替吉奧細(xì)胞治療的48例中晚期肝癌患者，其治療前后外周血免疫指標(biāo)分析結(jié)果顯示：總T淋巴細(xì)胞（CD3+）、T輔助細(xì)胞CD4+百分率，CD4+/CD8+比值明顯上升，與治療前對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05），NK細(xì)胞（CD16+CD56+）比例較前上升，T毒性/抑制細(xì)胞（CD3+CD8+）較前下降，但P﹥0.05（見(jiàn)表1）。

2.3 臨床癥狀緩解情況

48例中晚期肝癌患者經(jīng)1療程（12周）治療后在乏力、食欲不振、疼痛腹水、黃疸、腹脹等方面得到明顯緩解。（見(jiàn)表2）

2.4 KPS評(píng)分變化情況

經(jīng)積極治療后，大部分患者的KPS評(píng)分均得到提高，平均提高10～20分，總提高率高達(dá)89.6%。

2.5 毒副反應(yīng)

主要的不良反應(yīng)是中性粒細(xì)胞減少、消化道反應(yīng)及皮膚色素沉著，其中Ⅰ度粒細(xì)胞減少者6例，Ⅱ度減少2例，無(wú)Ⅲ、Ⅳ度減少者，經(jīng)粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）治療后粒細(xì)胞計(jì)數(shù)恢復(fù)正常，不影響繼續(xù)用藥。6例患者出現(xiàn)惡心癥狀，2例患者出現(xiàn)短暫嘔吐，48例患者均未出現(xiàn)Ⅲ度及以上消化道反應(yīng)。3例患者治療后出現(xiàn)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）輕度升高，加強(qiáng)護(hù)肝治療后ALT恢復(fù)正常并完成治療。4例患者回輸DC-CIK細(xì)胞后出現(xiàn)發(fā)熱，體溫均低于38.6℃，持續(xù)時(shí)間2～6小時(shí)，有1例給予酚咖片處理外，其他3分自行緩解。

3討論

晚期原發(fā)性肝癌至今尚沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的治療方案，與手術(shù)及介入治療相比，肝癌的全身化療始終處于艱難的探索中。其重要原因之一是肝癌細(xì)胞存在著多種耐藥機(jī)制，如多藥耐藥基因及其蛋白的高表達(dá)、p53基因突變、bcl-2和bc-lxl的異常表達(dá)等。另外，還存在著與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶和熱休克蛋白等相關(guān)的耐藥[2]?；煹哪康氖翘岣呋颊叩纳尜|(zhì)量，延長(zhǎng)患者的生存期。首選有效性的同時(shí)，還應(yīng)對(duì)藥物的副反應(yīng)進(jìn)行比較，特別是原發(fā)性肝癌患者，應(yīng)該選擇毒副反應(yīng)小藥物用于治療。

替吉奧是一種氟尿嘧啶衍生物口服抗癌劑，是替加氟（FT）、吉美嘧啶（CDHP）和奧替拉西鉀（Oxo）三種藥物組成的復(fù)方制劑，組成摩爾比1：0.4：1.FT是5-FU的前體藥物，口服吸收經(jīng)肝藥酶作用持續(xù)轉(zhuǎn)化為5-FU。CDHP是二氫嘧啶脫氫酶的強(qiáng)效抑制劑，可延長(zhǎng)血液和腫瘤組織中的5-Fu的藥效時(shí)間，從而取得與5-Fu持續(xù)靜脈輸注類似的療效。Oxo能夠阻斷5-Fu的磷酸化，減輕了5-Fu引起的胃腸道不良反應(yīng)。替吉奧與5-Fu相比具有以下優(yōu)勢(shì)：①能維持較高的血藥濃度并提高抗癌活性；②明顯減少藥毒性；③給藥方便。替吉奧在胃癌上已顯示較好的療效，甚至可以與聯(lián)合方案相媲美，在原發(fā)性肝癌的小樣本研究中也顯示出可喜的效果，且與5-Fu不完全交叉耐藥[3]。

乙型肝炎病毒慢性感染是我國(guó)肝癌的主要致病原因，患者體內(nèi)存在有不同程度的免疫功能缺陷。研究顯示[4]，肝癌患者存在外周血DC成熟障礙狀況，主要表現(xiàn)為循環(huán)DC低表達(dá)MHC-Ⅱ和IL-12；攝取抗原顆粒以及同種T細(xì)胞刺激能力下降。我們應(yīng)用的DC是經(jīng)過(guò)體外活化和擴(kuò)增，并經(jīng)過(guò)肝癌組織特異性抗原（AFP）刺激的成熟DC，國(guó)外實(shí)驗(yàn)證明，用AFP致敏的DC可抑制肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)，且對(duì)正常肝細(xì)胞的再生沒(méi)有影響[5]。我們應(yīng)用的CIK細(xì)胞是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子（如抗CD3McAb、IL-2、IFN-γ等）共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群高數(shù)量細(xì)胞群，單個(gè)療程可達(dá)1×109個(gè)，CIK兼具有淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的殺瘤活性和NK細(xì)胞的非主要組織相容性復(fù)合體限制性殺瘤特點(diǎn)。它是迄今發(fā)現(xiàn)的所有免疫效應(yīng)細(xì)胞中，增殖能力最強(qiáng)、細(xì)胞毒活性較強(qiáng)的細(xì)胞。DC和CIK細(xì)胞是腫瘤免疫治療的兩個(gè)重要部分，二者聯(lián)合可以有效提高機(jī)體的免疫功能，改善生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期，同時(shí)增加化療敏感性，降低化療不良反應(yīng)。以往認(rèn)為化療主要對(duì)機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制的負(fù)面影響。然而，近幾年來(lái)借助新的研究技術(shù)和較理想的動(dòng)物模型，對(duì)化療和免疫反應(yīng)的相互作用有了更深入的了解，認(rèn)為化療對(duì)腫瘤的免疫功能存在雙重的影響。而替吉奧為氟尿嘧啶類的氟化物，通過(guò)在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為5-FU，可作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，5-FU通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的抗原及MHC分子的表達(dá)，從而恢復(fù)CTL對(duì)靶細(xì)胞的特異性殺傷活性。通過(guò)選擇性清除MDSCs（Myeloid-derived suppessor cells 髓系來(lái)源抑制細(xì)胞），提高后續(xù)免疫治療的療效。本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)應(yīng)用自體DC-CIK聯(lián)合替吉奧治療，中晚期肝癌患者CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+Th細(xì)胞、CD4/CD8比率都有不同程度的增加，呈顯著性差異（p<0.05）。說(shuō)明DC-CIK能夠增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，改善機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)積極的DC-CIK聯(lián)合替吉奧治療后，患者的體能狀況KPS評(píng)分有所提高，總得提高率為90.5%，并且在臨床癥狀方面，明顯改善患者的疲乏、食欲不振、腹脹等癥狀。雖有部分患者有出現(xiàn)白細(xì)胞減少、消化道等不良反應(yīng)，但都比較輕微，經(jīng)短期處理后均可緩解。

綜上所述，自體免疫細(xì)胞DC-CIK聯(lián)合替吉奧治療中晚期肝癌，具有較好的抗腫瘤作用及輕微的毒副反應(yīng)，改善患者生活質(zhì)量，安全性高，是中晚期肝癌治療的新選擇。但本研究的病例數(shù)較少，觀察時(shí)間短，未能隨訪到生存時(shí)間，其臨床效果尚需大樣本前瞻性、對(duì)照的臨床試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。

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