運(yùn)用血清蛋白質(zhì)組分析方法篩選乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌相關(guān)抗原

朱麗英等

【摘要】目的：篩選乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌相關(guān)抗原（TAA），為研究乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及防治方案提供依據(jù)。方法：體外培養(yǎng)人乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌細(xì)胞株T-47D并提取總蛋白，取T-47D細(xì)胞總蛋白經(jīng)雙向電泳技術(shù)（2-DE）分離后轉(zhuǎn)膜，分別用20例健康人（N組）血清和20例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者（乳腺癌組）血清作為一抗進(jìn)行Western blot分析，找出差異蛋白、經(jīng)胰酶酶解后進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）鑒定。結(jié)果：篩選出10個(gè)差異蛋白，經(jīng)LC-MS/MS鑒定為熱休克蛋白90、脯氨酰-4-羥化酶β亞基、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-60蛋白酶、熱休克蛋白60、未命名蛋白、人類真核翻譯延伸因子1γ、假想蛋白、熱休克蛋白27、磷酸甘油酸變位酶1和核糖體蛋白P0。結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)了10個(gè)可能的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌TAA，此為進(jìn)一步研究乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及防治方案提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；雙向電泳；血清蛋白質(zhì)組分析；相關(guān)抗原

【中圖分類號(hào)】R722.12 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2014）04-0144-02

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2005-298）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（黔科合J字2007-2086）

乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌是乳腺癌中最常見的一種類型，預(yù)后較差[1]。腫瘤相關(guān)抗原（TAA）是在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中高表達(dá)的，能夠誘發(fā)機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答的抗原。血清學(xué)蛋白質(zhì)組分析（SERPA）是一種基于蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫學(xué)原理，利用二維電泳和質(zhì)譜分析方法篩選和鑒定TAA的新技術(shù)[2]，目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤、自身免疫性疾病及感染性疾病的研究中[3]，但其在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌研究中應(yīng)用的報(bào)道尚少。我們采用SERPA方法對(duì)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌TAA進(jìn)行了篩選，以期為該病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制研究及輔助診斷提供基礎(chǔ)。

1材料

1.1標(biāo)本來(lái)源

收集貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2010年12月至2011年3月期間收治的20例女性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者（無(wú)其它自身免疫性疾病）的靜脈血清作為實(shí)驗(yàn)組，所有病例取材得知情同意，采血和手術(shù)前未進(jìn)行放療、化療和內(nèi)分泌治療，年齡范圍34-78歲，平均年齡49.5歲；所有患者組織標(biāo)本均經(jīng)病理結(jié)果證實(shí)，按國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)（UICC）制定的乳腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)（TNM分期法）分為Ⅰ期6例，Ⅱ期7例，Ⅲ期7例。另外同期采集20例健康女性志愿者靜脈血清作為對(duì)照組，年齡范圍36-75歲，平均年齡52.8歲。健康志愿者均經(jīng)系統(tǒng)健康體檢，無(wú)乳腺相關(guān)疾病史、其它自身免疫性疾病和惡性腫瘤家族史。人乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌細(xì)胞株T-47D細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。納入本研究者采其空腹靜脈血5ml，盡快分離血清并置-80℃冰箱保存。

1.2主要試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；IPG膠條（13cm，pH3-10）、裂解液購(gòu)自Amershan biosciences公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗人IgG（HRP-兔抗人IgG）購(gòu)自武漢博士德公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜購(gòu)自美國(guó)Millpore公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及總蛋白的制備

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入5倍體積裂解液（7M尿素，2M硫尿，4%CHAPS，65mM DTT，0.2%Bio-Lyte）混勻，液氮中反復(fù)凍融3-4次（每次置液氮中3秒，室溫融化），加入20ug/ml脫氧核糖核酸酶，離心1小時(shí)（4℃，20000×g），取上清即為細(xì)胞總蛋白。用Bradford法檢測(cè)濃度，將樣品分裝并且置-80℃保存。

2.2 雙向電泳和Western blot分析

取700μg T-47D全細(xì)胞蛋白進(jìn)行2-DE，2-DE操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。2-DE所得凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色2h；并脫色至蛋白點(diǎn)清晰可見為止。

T-47D細(xì)胞總蛋白經(jīng)雙向電泳分離后，半干轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)印至PVDF膜并封閉2h，分別與1：100稀釋的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌或?qū)φ昭澹ㄒ豢梗┯谑覝胤跤?h，用TBST洗膜液洗膜（10min×3次）；其次與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗人（1：3000）二抗室溫孵育2h；再經(jīng)TBST溶液洗膜（10min×3次）；最后經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)得到膠片；觀察雜交信號(hào)點(diǎn)，并確定發(fā)生免疫反應(yīng)的蛋白在雙向電泳凝膠上的位置。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，用X2檢驗(yàn)對(duì)與患者血清和對(duì)照血清發(fā)生免疫反應(yīng)的蛋白進(jìn)行分析，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4候選蛋白酶解和質(zhì)譜鑒定

選取2-DE凝膠上候選蛋白質(zhì)斑點(diǎn)經(jīng)胰酶酶解，肽段經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析，用Mascot搜索引擎搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)，獲知氨基酸序列。

3 結(jié)果

3.1 T-47D細(xì)胞總蛋白2-DE分析

使用圖像分析軟件對(duì)T-47D細(xì)胞總蛋白雙向電泳圖譜進(jìn)行分析，在分子量為14.4.0kDa-94kDa和等電點(diǎn)pI3.0-10.0的范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)約630個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)（圖1）。

3.2 T-47D細(xì)胞總蛋白與血清的Western blot分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

T-47D細(xì)胞總蛋白和對(duì)照血清發(fā)生免疫反應(yīng)的蛋白較少，大約為4個(gè)蛋白點(diǎn)（圖2）；而其與患者血清發(fā)生免疫反應(yīng)的蛋白較多，大約14個(gè)蛋白點(diǎn)（圖3）。采用SPSS17.0軟件對(duì)與患者血清和對(duì)照血清發(fā)生免疫反應(yīng)的蛋白進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，篩選出10個(gè)差異蛋白（表1）。這10個(gè)差異蛋白分別與對(duì)照組（N）和實(shí)驗(yàn)組（BC）血清發(fā)生免疫反應(yīng)印跡圖（圖4）；確定這10個(gè)差異蛋白在2-DE凝膠上的位置，其主要分布在分子量為22.0kDa-94kDa和等電點(diǎn)pI4.7-6.7的范圍內(nèi)（圖5）。

4 討論

分離鑒定TAA有可能發(fā)現(xiàn)新的輔助早期診斷、預(yù)后判斷和療效監(jiān)測(cè)的候選腫瘤標(biāo)志物。本研究運(yùn)用SERPA方法對(duì)引起乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者發(fā)生體液免疫反應(yīng)的抗原進(jìn)行檢測(cè)并篩選出10個(gè)抗原，經(jīng)質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)搜索，鑒定出其中8個(gè)抗原的功能，主要涉及到分子伴侶、能量代謝、細(xì)胞信號(hào)；有兩個(gè)抗原未鑒定出功能。HSP90、P4HB、ER-60、HSP60、HSP27屬于分子伴侶蛋白，是原核和真核生物細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下可被誘導(dǎo)表達(dá)的一類具有重要生理功能和高度保守的多肽類蛋白質(zhì)分子家族。多項(xiàng)國(guó)內(nèi)外研究[4]顯示，上述五種蛋白在乳腺癌患者體內(nèi)表達(dá)升高，本研究結(jié)果與之一致。PGAM1是一種糖分解酶，主要在糖酵解過(guò)程中起作用，因而能促進(jìn)癌細(xì)胞等糖酵解旺盛的細(xì)胞生存。研究發(fā)現(xiàn)，PGAM1在肺癌、肝癌和食管癌中表達(dá)明顯升高，但在乳腺癌腫瘤抗原方面的研究罕見報(bào)道。因此，PGAM1在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的作用值得進(jìn)一步探討。EEF1G和P0屬于信號(hào)類蛋白，其中EEF1G含有N-末端谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶域，可與氨基酰-tRNA結(jié)合，將其運(yùn)至核糖體，使肽鏈延長(zhǎng)；P0是一種多功能蛋白，參與翻譯過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，EEF1G和P0在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯升高，但P0表達(dá)升高或降低在病理、生理代謝中的具體作用目前尚未清楚，其在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的作用待于進(jìn)一步研究。本研究中兩個(gè)未鑒定出功能的蛋白是未命名蛋白和假想蛋白，其結(jié)構(gòu)和功能還不清楚。

參考文獻(xiàn)

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[3] 李良宏.乳腺癌中HSP90和Caspase-3的表達(dá)及其與臨床病理、預(yù)后的關(guān)系[J].疑難病雜志，2012，11（4）：271-273.

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