微波萃取液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定水產(chǎn)品中甲基汞、乙基汞和無(wú)機(jī)汞

王賢波　 劉軍波　 余霞奎等

摘要 [目的]研究水產(chǎn)品中甲基汞、乙基汞和無(wú)機(jī)汞的檢測(cè)方法。[方法]采用Hypersil gold 150×4.6 mm色譜柱進(jìn)行HPLC分離條件優(yōu)化，用含Li、Co、In、U各1 μg/L的調(diào)諧液進(jìn)行ICPMS參數(shù)優(yōu)化，對(duì)樣品進(jìn)行微波萃取。[結(jié)果]采用鹽酸微波萃取樣品，C18柱（150×4.6 mm）分離，流動(dòng)相為5%甲醇-0.06 mol/L乙酸銨-1 g/L半胱氨酸。甲基汞、乙基汞的線性范圍均為0.5～100.0 μg/L，檢出限分別為0.2、0.3 μg/L；無(wú)機(jī)汞線性范圍均為0.5～20.0 μg/L，檢出限為0.2 μg/L。不同濃度下甲基汞、乙基汞、無(wú)機(jī)汞的加標(biāo)回收率分別為89%～98%、82%～89%、86%～96%。魚肉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW10029）中汞形態(tài)的測(cè)定均值在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)。 [結(jié)論]該方法前處理簡(jiǎn)便、精密度高、準(zhǔn)確性好，適用于水產(chǎn)品中汞化合物的形態(tài)分析。

關(guān)鍵詞 微波萃??；液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜；甲基汞；乙基汞；無(wú)機(jī)汞

中圖分類號(hào) S181.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）08-02438-03

Simultaneous Determination of the Content of Methyl Mercury，Ethyl Mercury and Inorganic Mercury in Microwave Extraction of Aquatic Products by HPLCICPMS

WANG Xianbo et al （Laboratorial Center， Hangzhou Institute of Agricultural Sciences， Hangzhou， Zhejiang 310024）

Abstract [Objective] To observe the detection method of methyl mercury（MMC）， ethyl mercury（EMC） and inorganic mercury（MC） in aquatic products. [Method] Using Hypersil gold 150 × 4.6 mm chromatographic column for optimization of HPLC separation conditions， The ICPMS parameter optimization using tuned liquid containing Li， Co， In， U 1 μg/L， The samples were extracted by microwave. [Result] The sample was extracted with hydrochloric acid and separated on a C18 chromatographic column（150 × 4.6 mm） using 5% methanol0.06 mol/L ammonium acetate1 g/L cysteine as mobile phase. The linear ranges for methyl mercury and ethyl mercury were all between 0 and 100 μg/L with the detection limits 0.2 μg/L and 0.3 μg/L. The linear ranges for inorganic mercury was 0 and 20 μg/L with the detection limits 0.2 μg/L. The spiked recoveries for different concentrations of mercury compounds were in the range of 89%98% for MMC， 82%-89% for EMC and 86%96% for MC. The method was applied in the determination of mercury speciations in fish reference material（GBW 10029） and the analytical result was in the scope of standard value. [Conclusion] The results indicated that the method had a simple pretreatment procedure， good accuracy and precision， and was suitable for the determination of mercury speciations in aquatic products.

Key words Microwave extraction； HPLCICPMS； Methyl mercury； Ethyl mercury； Inorganic mercury

汞是對(duì)人類和高等生物最具危害的元素之一，有機(jī)汞化合物在農(nóng)業(yè)中常用作殺蟲劑和殺菌劑，無(wú)機(jī)汞通過(guò)生物甲基化作用生成毒性更強(qiáng)的甲基汞，從而被動(dòng)植物吸收，并通過(guò)食物鏈的富集作用進(jìn)入人體，其富集倍數(shù)可高達(dá)106～107[1]。汞化合物的毒性依賴于其濃度及化學(xué)形態(tài)，烷基汞的毒性比芳基汞和無(wú)機(jī)汞大，甲基汞是毒性最強(qiáng)的汞化合物之一[2]。鑒于不同形態(tài)汞化合物的毒性差異，采用高靈敏度的形態(tài)分析方法測(cè)定環(huán)境樣品和生物樣品中汞的含量非常必要[3]。

目前測(cè)定汞形態(tài)的方法很多。最早的方法標(biāo)準(zhǔn)為氣相色譜法[4]，但該方法存在前處理繁瑣，需要對(duì)樣品進(jìn)行多步萃取和凈化以減少基體干擾，巰基棉回收率不穩(wěn)定，進(jìn)樣過(guò)程中需要定期往色譜柱內(nèi)注入二氯化汞苯飽和溶液對(duì)色譜柱進(jìn)行“鈍化”， 以保證峰的重現(xiàn)性等問(wèn)題。液相色譜[5] 、氣相色譜與光譜技術(shù)聯(lián)用也被用于分析汞化合物[6-9]。高效液相色譜以其前處理簡(jiǎn)單、適用性強(qiáng)，可與原子吸收（AAS） 、原子熒光（AFS）、電感耦合等離子質(zhì)譜（ICPMS）、電感耦合等離子光譜（ICPAES）等多種技術(shù)聯(lián)用而廣泛應(yīng)用于汞形態(tài)分析[10-11]。筆者采用鹽酸微波提取水產(chǎn)品中的汞，以半胱氨酸取代劇毒管制試劑巰基乙醇為絡(luò)合劑，采用微波萃取液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLC ICPMS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)其中的甲基汞、乙基汞、無(wú)機(jī)汞的含量進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑。包括色譜柱（Thermo Hypersil gold 150×4.6 mm）、鹽酸、氨水（優(yōu)級(jí)純）、甲醇（色譜純）、半胱氨酸（生化試劑）、乙酸銨（分析純）、汞標(biāo)準(zhǔn)溶液為甲基汞（MMC）GSB 0715032002，濃度為10 mg/L；乙基汞（EMC）GSB 0715042002，濃度為10 mg/L；無(wú)機(jī)汞（MC）GSB0712742000，濃度為100 mg/L，魚肉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10029，均購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.1.2 主要儀器。包括電感耦合等離子體質(zhì)譜（Thermo X Series 2）、高效液相色譜（戴安 UltiMate3000）、微波萃取儀（CEM Explorer）、離心機(jī)3-30K（德國(guó) Sigma）、純水儀（Millipore MilliQ）、電子天平（METTLER公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。分別取一定量甲基汞、乙基汞、無(wú)機(jī)汞，用超純水稀釋定容，配成1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，所配溶液均儲(chǔ)存于4 ℃的冰箱中。汞標(biāo)準(zhǔn)工作液由1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用流動(dòng)相與2%鹽酸按1∶1逐級(jí)稀釋而成， 使用時(shí)現(xiàn)配。

1.2.2 ICPMS參數(shù)優(yōu)化。配制含Li、Co、In、U各1 μg/L的調(diào)諧液，運(yùn)行儀器，將溶液進(jìn)樣管插入到調(diào)諧液中，并調(diào)節(jié)炬箱水平（minorhorizontal）、垂直位置（minorvertical）以及霧化器流速（majornebuliser）等幾個(gè)參數(shù)設(shè)置，通過(guò)觀察Li、Co、In、U四元素的信號(hào)強(qiáng)度的大小，使儀器靈敏度達(dá)到最佳。

1.2.3 HPLC分離條件優(yōu)化。分別配制含0.06 mol/L乙酸銨、1 g/L半胱氨酸的5%甲醇水溶液，含0.06 mol/L乙酸銨、1g/L 2-巰基乙醇的5%甲醇水溶液作為流動(dòng)相。采用熱電公司Hypersil gold 150×4.6 mm色譜柱，柱溫30 ℃，流速1 ml/min。用超純水配制含有甲基汞、乙基汞、無(wú)機(jī)汞的混合溶液，濃度均為1 μg/L，進(jìn)樣量100 μl，等流速洗脫。

1.2.4 微波萃取條件。取0.50 g樣品，加入10 ml 5 mol/L鹽酸，在80 ℃、微波功率800 W條件下微波萃取10 min。8 000 rpm離心10 min，收集上清液，用氨水調(diào)節(jié)pH至7左右，用去離子水稀釋定容至25 ml，0.45 μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 電感耦合等離子質(zhì)譜（ICPMS）參數(shù) 通過(guò)調(diào)節(jié)儀器的各項(xiàng)參數(shù)，得到ICPMS儀器工作條件分別為射頻功率1 400 W、排廢液泵速30 rpm、霧化器旋流霧室、霧化器流量0.92 L/min、冷卻氣流量13.0 L/min、輔助氣流量0.80 L/min、采樣深度150步、模擬電壓1 800 V、脈沖電壓2 920 V、駐留時(shí)間0.4 s。為了消除錐口的碳沉積，需要降低霧室的溫度，同時(shí)流動(dòng)相中含有大量的水，為防止霧化室結(jié)冰又不宜使用過(guò)低的溫度，所以該試驗(yàn)中使用2 ℃，該溫度既可以減少進(jìn)入ICPMS的有機(jī)試劑總量，又不會(huì)導(dǎo)致霧化室結(jié)冰。

2.2 HPLC分離條件 當(dāng)采用5%甲醇、0.06 mol/L乙酸銨、1 g/L 2巰基乙醇為流動(dòng)相時(shí)，3種汞化合物能完全分離（圖1a），但分離時(shí)間長(zhǎng)，需要32 min，且2巰基乙醇屬劇毒管制試劑，氣味難聞；當(dāng)采用5%甲醇、0.06 mol/L乙酸銨、1 g/L半胱氨酸為流動(dòng)相時(shí)，3種汞化合物在8 min內(nèi)能完全分離（圖1b），且半胱氨酸無(wú)毒無(wú)害，故此試驗(yàn)選用半胱氨酸為絡(luò)合劑。

圖1 以2-巰基乙醇（a）和半胱氨酸（b）為絡(luò)合劑的3種汞形態(tài)分離質(zhì)譜圖

2.3 線性范圍、檢出限試驗(yàn) 配制一系列3種汞化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、100.0 μg/L，在優(yōu)化試驗(yàn)條件下進(jìn)行線性范圍試驗(yàn)，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍基線噪聲測(cè)定3種汞形態(tài)的檢出限（S/N=3），結(jié)果（表1）發(fā)現(xiàn)，甲基汞、乙基汞在0.5～100.0 μg/L范圍內(nèi)有良好的線性，檢出限分別為0.2、0.3 μg/L；無(wú)機(jī)汞在0.5～20.0 μg/L范圍內(nèi)有良好的線性，檢出限為0.2 μg/L，無(wú)機(jī)汞在100.0 μg/L時(shí)測(cè)定值偏低，這可能與無(wú)機(jī)汞不太穩(wěn)定有關(guān)。

2.4 精密度試驗(yàn) 配制質(zhì)量濃度為10 μg/L甲基汞、乙基汞、無(wú)機(jī)汞3種汞化合物混合溶液，在同一日內(nèi)多次重復(fù)進(jìn)樣，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)得的濃度，以測(cè)得的濃度計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。由表2可見(jiàn)，甲基汞、乙基汞、無(wú)機(jī)汞在同一日內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，其RSD均小于5%。由于天然水產(chǎn)品中很難找到3種汞化合物均存在的樣品，因此模擬制備3個(gè)濃度的樣品，平行測(cè)定其汞化合物含量，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（表3）發(fā)現(xiàn)，模擬樣品低、中、高3個(gè)濃度均具有良好的精密度，RSD均小于5%。

2.5 加標(biāo)回收率 分別向鯽魚樣品中加入3種不同濃度汞化合物，測(cè)定3種汞化合物的加標(biāo)回收率，由表4可見(jiàn)，不同加標(biāo)濃度的回收率分別為甲基汞89%～98%、乙基汞82%～89%、無(wú)機(jī)汞86%～96%。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定 用HPLCICPMS對(duì)魚肉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW10029）進(jìn)行汞化合物測(cè)定。由圖2可知，魚肉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中主要為甲基汞，魚肉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定均值為838.3 μg/kg，參考值為840±30 μg/kg，可見(jiàn)試驗(yàn)結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

3 結(jié)論與討論

采用HPLCICPMS測(cè)定水產(chǎn)品中的甲基汞、乙基汞和無(wú)機(jī)汞，對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，用半胱氨酸取代劇毒管制試劑巰基乙醇且分析時(shí)間縮短。汞化合物各形態(tài)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%，該方法前處理簡(jiǎn)單、精密度高、準(zhǔn)確性好，適用于水產(chǎn)品中汞形態(tài)的測(cè)定。

用PEEK管連接色譜柱和霧化室，由于使用C18反相柱時(shí)，色譜流動(dòng)相中需加入有機(jī)溶劑，但高有機(jī)負(fù)載可能導(dǎo)致ICPMS分析信號(hào)的不穩(wěn)定，尤其是甲醇分解所產(chǎn)生的碳粉可能導(dǎo)致ICPMS錐口的堵塞，所以選用含碳量較少的甲醇，而不使用乙腈，且甲醇使用濃度僅為5%（V/V）。另外，在流動(dòng)相中加入少量乙酸銨以改善峰形，加入1 g/L半胱氨酸以確保Hg的洗脫效率，同時(shí)可以較好地消除離子型Hg的記憶效應(yīng)[12]。3種形態(tài)的汞在反相色譜中出峰順序依次為甲基汞、乙基汞、無(wú)機(jī)汞。

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