紅堿淖遺鷗血液基因組DNA提取方法的比較研究

行文珍，雷 忻，戚珍珠，田鵬飛，張靜靜

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

遺鷗(Ichthyaetus relictus)，隸屬于鸻形目(Charadriiformes)鷗科(Laridae)鷗屬(Larus)［1］，目前繁殖地集中在蒙古國(guó)(數(shù)處)、哈薩克斯坦(2處)、俄羅斯(1處)和中國(guó)(1處)，其越冬地在中國(guó)和韓國(guó)亦有發(fā)現(xiàn)［2－3］。1931年，瑞典博物學(xué)家艾納·隆伯格(Ejnar Lonnberg)首次撰文提及其在中國(guó)內(nèi)蒙古額濟(jì)納旗境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的遺鷗標(biāo)本，但其認(rèn)為遺鷗是黑頭鷗在東方的一個(gè)變種。1971年才被蘇聯(lián)鳥(niǎo)類學(xué)家Auezov確立為有效物種［4］，同時(shí)被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)和《遷徙物種公約》(MSC)附錄Ⅰ，在IUCN發(fā)布的《紅皮書(shū)》一直被列為受威脅鳥(niǎo)種，是世界珍稀瀕危鳥(niǎo)類，也是我國(guó)一級(jí)保護(hù)鳥(niǎo)類［5－6］。目前，陜西省神木縣紅堿淖濕地是國(guó)內(nèi)最大的遺鷗繁殖種群［7］，針對(duì)該種群開(kāi)展分子生物學(xué)研究，對(duì)于拯救和保護(hù)這一瀕危鳥(niǎo)種具有重要的科學(xué)價(jià)值和實(shí)際意義。

分子生物學(xué)技術(shù)在珍稀瀕危鳥(niǎo)類的遺傳、進(jìn)化、種群關(guān)系、物種鑒定、性別鑒定等多方面的研究都有較廣的應(yīng)用，但是由于珍稀瀕危鳥(niǎo)類取樣困難，十分珍貴，因此選擇高效的DNA提取方法尤為重要。本文采用改良的Miller的鹽析法和酚－氯仿法分別對(duì)紅堿淖遺鷗血液基因組DNA進(jìn)行提取，并比較2種方法的提取效果，以期篩選簡(jiǎn)便、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的有效提取方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

遺鷗血液樣品，采集于陜西省神木縣紅堿淖濕地，－20℃冷凍保存。

1.2 試驗(yàn)方法

參照柯柳玉［8］、王敏強(qiáng)［9］的禽血基因組 DNA提取方法并加以改良，分別采用酚－氯仿法和改良Miller鹽析法從遺鷗冷凍血液樣品中提取基因組DNA，酶解時(shí)間分別為10 h和16 h。

1.2.1 酚－氯仿法

取適量冷凍血液于室溫下自然解凍，置于離心管中，加入10倍體積的動(dòng)物血裂解液，顛倒混勻，再加入蛋白酶K使其終濃度達(dá)到100 μg/mg，顛倒混勻，55℃水浴10 h。加入等體積酚，輕輕顛倒混勻20 min，4℃ 12000 r/min離心5 min，取上清，重復(fù)上面步驟一次，取上清于另一潔凈離心管中，加入等體積酚、氯仿和異戊醇混合液(體積比=25∶24∶1)，輕輕顛倒混勻20 min，4℃ 12000 r/min離心5 min，取上清重復(fù)上一步驟，取上清加入等體積的氯仿和異戊醇混合液(體積比=24∶1)，輕輕顛倒混勻20 min，4 ℃ 12000 r/min離心5 min，取上清，加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉溶液(pH=5.2)，二倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，室溫放置15 min，12000 r/min離心5 min，棄上清，再用75%乙醇洗滌沉淀2次，室溫干燥后溶于20 μL無(wú)菌水。

1.2.2 改良Miller鹽析法

參照任春環(huán)［10］、苗永旺［11］的基因組快速提取方法。取適量冷凍血液置于室溫下自然解凍后，將其轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，加4倍體積的紅細(xì)胞裂解液，混勻，4℃ 12000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)上面步驟，至細(xì)胞團(tuán)成粉白色。加8倍體積的生理鹽水混勻，4℃ 12000 r/min離心5 min，棄上清。加入3 mL NLB(白細(xì)胞裂解液))+SDS(十六烷基硫酸鈉)緩沖液，50 μL 蛋白酶 K 溶液，400 μL 10%SDS溶液，混勻，55℃ 10 h加入1/4體積6 mol/L NaCl，顛倒混勻，4℃ 12000 r/min離心10 min。取上清于加入2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇中沉淀，輕搖至DNA析出，靜止30 min，12000 r/min離心2 min，小心倒掉上清液。用75%乙醇洗滌沉淀2次。室溫干燥后溶于20μL無(wú)菌水。

1.2.3 DNA質(zhì)量檢驗(yàn)

取0.15 g瓊脂糖放入錐形瓶中，加入10 mL 0.5×TBE(四溴乙烷Tetra Bromo Ethane)緩沖液，置于微波爐中加熱至完全融化并搖勻，則為0.8%瓊脂糖凝膠液。

取制膠梳、制膠板，用蒸餾水洗凈晾干后置水平位置。放好梳子后，將冷卻到60℃左右的瓊脂糖凝膠液沿膠板一側(cè)緩慢地一次性倒入，注意不要形成氣泡。室溫凝膠大約30 min，膠凝固后拔出梳子，將膠放入電泳槽內(nèi)，在其中加入0.5×TBE電泳緩沖液。

取5 μL DNA 原液與2 μL 10 ×Loading Buffer混勻，然后點(diǎn)入加樣孔，接通電泳槽與電泳儀的電源，電壓80 V，30 min，停止電泳。取出膠放入EB溶液中染色約10 min后，使用凝膠成像儀檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 直接觀察

酚－氯仿法提取遺鷗基因組DNA呈絮狀，易干燥，易溶解;改良Miller鹽析法提取遺鷗基因組DNA呈絲膠狀，不易干燥，難溶解。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳

圖1 酚－氯仿法和改良Miller鹽析法提取遺鷗基因組DNA電泳圖

圖2 酚－氯仿法不同酶解處理時(shí)間DNA電泳圖

由圖1可見(jiàn)，酚氯仿法獲得的DNA樣品亮度高和清晰度很高，條帶較粗，降解少，基本無(wú)拖尾現(xiàn)象;改良Miller鹽析法樣品亮度和清晰度均不高，條帶較細(xì)，有拖尾現(xiàn)象，表明酚 －氯仿抽提法提取的DNA濃度高于改良Miller鹽析法。

由圖2可見(jiàn)，酚－氯仿法提取DNA時(shí)，蛋白酶K水解10 h和16 h時(shí)的提取結(jié)果有明顯差異，酶解時(shí)間為10 h提取出來(lái)的樣品清晰度不高，條帶較細(xì)，而酶解時(shí)間為16 h提取出的樣品亮度和清晰度明顯較高，條帶較粗。表明水浴時(shí)間越長(zhǎng)，提取的DNA濃度越高。

3 討論

任春環(huán)［10］等在提取山羊全血DNA時(shí)，比較了酚－氯仿抽提法、碘化鉀法方法，認(rèn)為改良Miller鹽析法操作步驟復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)。曹巖峰［12］等采取酚－氯仿抽提法提取了牛凝血塊基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和PCR檢測(cè)，結(jié)果良好，只是濃度偏低。曹果清［13］等對(duì)組織中提取DNA的方法進(jìn)行改進(jìn)，先對(duì)凝血塊進(jìn)行預(yù)處理，用組織DNA抽提液裂解細(xì)胞，然后經(jīng)過(guò)酚－氯仿抽提無(wú)水乙醇沉淀等步驟即可獲得濃度高、純度好、結(jié)構(gòu)完整的DNA分子。Pietro［14］、Wang［15］等也認(rèn)為酚 － 氯仿法較其他方法好。本研究結(jié)果顯示，酚－氯仿法和改良Miller鹽析法對(duì)遺鷗基因組DNA提取都較為有效，但兩種方法相比較，酚－氯仿法提取的DNA總量與質(zhì)量較好，且穩(wěn)定，而改良Miller鹽析法雖操作比較簡(jiǎn)單，但提取DNA純度和質(zhì)量均較差些。因此，酚－氯仿法在紅堿淖遺鷗冷凍血液基因組DNA的提取中，效果明顯優(yōu)于改良Miller鹽析法。

蛋白酶K能有效地分離核酸和蛋白質(zhì)，其消化時(shí)間是影響DNA提取效果的關(guān)鍵因素。目前，大多數(shù)研究采用55℃水浴過(guò)夜的方式進(jìn)行消化，這是傳統(tǒng)酚－氯仿法中最耗時(shí)的環(huán)節(jié)。本研究分別采用酚－氯仿法酶解10 h和16 h的方法，對(duì)遺鷗基因組DNA進(jìn)行提取，比較電泳結(jié)果，觀察到酶解10 h時(shí)提取樣品的清晰度低，條帶細(xì)，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，而酶解時(shí)間16 h時(shí)提取樣品的亮度和清晰度明顯較高，條帶較粗，提示酶解16 h時(shí)的DNA提取效果優(yōu)于酶解10 h，說(shuō)明在一定時(shí)間范圍內(nèi)，蛋白酶K對(duì)遺鷗冷凍血液樣品處理時(shí)間越長(zhǎng)，基因組DNA提取效果越好。

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