沙門氏菌可替代方法實驗室內驗證程序研究

馬 云 王明鑑 賈 臻 羅世芝 王海霞 郭 君 姚廣紅 王 茸 賈俊濤

（1.山東出入境檢驗檢疫局 山東青島 266002; 2.山東一品農產集團有限公司; 3.青島酒店管理職業(yè)技術學院）

1 前言

沙門氏菌是最常見的食源性致病菌之一，在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首[1-3]。目前，沙門氏菌檢測的基準方法仍是依賴于培養(yǎng)、生化鑒定和血清學的傳統(tǒng)方法，由于其耗時費力，不能及時發(fā)現(xiàn)生產過程中的問題，因此已不適應生產的需要，迫切需要快速、準確的“可替代方法”（alternative methods）用于食品原料、加工過程以及終產品的實時檢測。

可替代方法需與參照方法（基準方法）進行比較，以證明該方法對“預期目標的適用性”，此過程稱為“方法驗證”（validation of methods）。對于微生物檢測可替代方法的驗證，國際上有明確的規(guī)范，如：ISO 16140:2003/Amd 1:2011《食品和動物飼料微生物學-可替代方法的驗證方案》（以下簡稱“ISO 16140”）和《AOAC國際方法委員會關于食品和環(huán)境表面微生物方法的驗證指南》等；國內在方法驗證方面僅有關于試劑盒評價的行業(yè)標準[4,5]，未見系統(tǒng)的相關報道。此外，方法驗證和實驗室認可之間也存在著密切聯(lián)系[6]。根據實驗室認可要求CNAS-CL01《檢測和校準實驗室能力認可準則》（等同采用ISO/IEC 17025:2005）的規(guī)定：實驗室應對非標準方法、實驗室設計（制定）的方法、超出其預定范圍使用的標準方法、擴充和修改過的標準方法進行確認（validation of methods，也即“方法驗證”），以證實該方法適用于預期的用途。方法驗證與能力驗證、參考物質一起并稱為質量保證的三大“基石”[6]，應當引起實驗室檢測人員的重視。

方法驗證包括“實驗室內驗證”（即“實驗室內方法比較研究”）和“實驗室間驗證”（即“實驗室間協(xié)作研究”）兩大部分[7]。本研究依據ISO 16140，以賽默科技SureTect沙門氏菌實時PCR檢測方法（以下簡稱“SureTect方法”）為例，對其參照GB 4789.4-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（以下簡稱“GB 4789.4”）進行了實驗室內驗證，以期詳細介紹沙門氏菌可替代方法實驗室內驗證的具體程序，并為開展類似實驗室內驗證工作提供參考程序。本研究以一種沙門氏菌定性檢測方法為例進行了實驗室內驗證，僅僅是開展方法驗證工作過程中一次初步的嘗試，今后還需在微生物定量檢測方法的驗證以及實驗室間驗證方面開展更深入細致的工作。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 菌株

包括沙門氏菌30株和干擾菌30株（見表1），主要來自美國模式培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）、中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）、中國醫(yī)學細菌保藏管理中心（CMCC）及本實驗室日常檢測分離。

表1 菌株信息表

（續(xù)表）

2.1.2 主要儀器

生化培養(yǎng)箱（MIR-553）：日本三洋公司；實時PCR儀（SureTect）：賽默科技；恒溫搖床（Excella E25R）：美國New Brunswich Scientific。

2.1.3 培養(yǎng)基及試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）：美國OXOID公司；四硫磺酸鈉煌綠（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA-YE）、三糖鐵（TSI）瓊脂、賴氨酸脫羧酶瓊脂、尿素酶瓊脂、沙門氏菌生化鑒定管套裝、沙門氏菌O多價血清：北京陸橋技術有限責任公司；菌落總數(shù)測試片：美國3M公司；SureTect 沙門氏菌PCR配套試劑盒（包括蛋白酶K、裂解試劑管和PCR管）：賽默科技。

2.2 方法

2.2.1 樣品基質的制備

根據ISO 16140附表B.1，沙門氏菌可替代方法的驗證應選取肉、禽、水產品、果蔬和乳品等五大類食品為樣品基質。樣品均購自大型購物超市，無菌包裝后在0-4℃條件下2h內運回實驗室。不同類別的樣品在無菌條件下分別混勻，0-4℃冷藏待用。

2.2.2 菌液的制備

所有菌株均取自-80℃冰箱，TSA-YE上37℃活化，挑取單菌落在TSA-YE上純化；再挑取純培養(yǎng)后的單菌落接種到10mL的BPW中，120rpm/min搖床培養(yǎng)24h；取1mL菌液加入9mL生理鹽水中，依次系列稀釋備用，同時用菌落總數(shù)測試片計數(shù)每個稀釋度菌液的濃度。

2.2.3 待驗證方法——SureTect方法

樣品和BPW按1:9稀釋，在均質器上混合均勻，于37℃±1℃培養(yǎng)20h-24h；吸取10μL試劑盒配套蛋白酶K溶液到SureTect裂解試劑管（預裝裂解液）中，再加入10μL BPW增菌肉湯，37℃孵育10min后立即于95℃孵育5min；吸取20μL裂解產物至PCR管（預裝SureTect凍干PCR試劑）中，復溶凍干試劑；PCR管放入儀器并運行配套軟件，約1.5h后從軟件上讀取結果。

2.2.4 相對準確性、相對特異性和相對靈敏度的測定和比較

相對準確性是指可替代方法和參照方法對同一樣品檢測獲得結果的一致程度，相對靈敏度是指可替代方法能檢出參照方法確認的分析物的能力，相對特異性是指可替代方法將參照方法確認的非分析物排除的能力[7]。

這3個指標驗證過程如下：肉、禽、水產品、果蔬和乳品各稱取60個樣品，每個樣品25g，分別放于無菌均質袋中。采用人工污染的方式制備樣品，嚴格控制樣品的污染水平（大約在0-10CFU/g），干擾菌株的添加水平比陽性菌株高約一個數(shù)量級。每個樣品添加1mL稀釋好的沙門氏菌菌液和1mL干擾菌菌液，混合均勻。采用SureTect方法和GB4789.4同時檢測每一個樣品。記錄所有檢測結果，按下列公式[7]計算SureTect方法相對準確性、相對特異性和相對靈敏度：

式中：AC—相對準確性；SP—相對特異性；SE—相對靈敏度；PA—陽性符合（真陽性）的數(shù)目；PD—陽性偏差（假陽性）的數(shù)目；ND—陰性偏差（假陰性）的數(shù)目；NA—陰性符合（真陰性）的數(shù)目。

按照ISO 16140 附件F的統(tǒng)計檢驗方法判斷兩種方法相對準確性、相對特異性和相對靈敏度的一致性。

2.2.5 相對檢測限的測定和比較

混勻的肉、禽、水產品、果蔬和乳品各稱取18個樣品，每個樣品25g，放于無菌均質袋中。每類食品的18個樣品平均分成3組，3組分別接種沙門氏菌菌液達到不同污染水平（0、約0.04CFU/g和約0.12CFU/g），每個樣品分別用兩種方法同時進行檢測。

根據菌落總數(shù)測試片計數(shù)獲得的菌液原始濃度換算出后兩個水平樣品污染菌的濃度；根據3個污染水平的檢出情況和3個污染水平的菌濃度報告方法的相對檢出限，用Fisher確切概率法[8]檢驗每一水平上兩種方法相對檢測限的差異。

2.2.6 包含性和排他性試驗

按照ISO 16140附件G的原則選取30株沙門氏菌作為目標菌，同時選取30株近似菌作為干擾菌。所有菌株在試驗前需經生化、血清或分子生物學鑒定，每株測試菌株接種到培養(yǎng)基中進行測試。目標菌的接種水平是待驗證方法相對檢測限的10到100倍，干擾菌的接種水平為預計樣品中細菌最大污染水平（確定為約105CFU/g）。當待驗證方法對目標菌的測試出現(xiàn)假陰性時，應對該菌重新測試，并同時采用GB 4789.4方法驗證；當對干擾菌的測試出現(xiàn)假陽性或可疑時，僅采用被驗證方法對該菌重新測試。記錄所有檢測結果。

3 結果與討論

3.1 相對準確性、相對特異性和相對靈敏度

可替代方法實驗室內驗證過程中的相對準確性、相對特異性和相對靈敏度與傳統(tǒng)的方法準確性、特異性和靈敏度概念不同。前者是對很低污染水平（檢出限附近）的樣品檢測后與參照方法的檢測結果比較后獲得，容易出現(xiàn)假陰性的情況；而后者則是對較高污染水平的樣品檢測后與預期結果（通常不是參照方法獲得的結果）比較后獲得，通常呈現(xiàn)高度一致（接近100%）。

對于5類人工污染的食品樣品，分別采用SureTect方法和GB 4789.4同時進行檢測，結果見表2。

表2 SureTect方法的相對準確性、相對特異性和相對靈敏度的計算

表2顯示，SureTect方法的相對準確性、相對特異性和相對靈敏度均偏低，最低為75%，需根據ISO16140附件F的檢驗方法來確定SureTect方法與GB 4789.4是否存在差異。

由表2可得出5類食品都符合6≤Y（Y=PD+ND）≤22的情況，PD和ND中較小的值

都大于ISO 16140附表F.1中的M值，因此可以判定兩種方法之間無顯著性差異（α<0.05）。

3.2 相對檢測限

分別采用SureTect方法和GB 4789.4同時檢測3個不同污染水平樣品，結果見表3。

表3 SureTect方法相對檢測限的計算

根據接種菌液計數(shù)結果推算，水平1接種濃度是0，水平2接種濃度約是0.03CFU/g，水平3接種濃度約是0.10CFU/g。由于水平1結果全部為陰性，不能用于相對檢測限，SureTect方法的相對檢測限位于水平2和水平3之間（0.03CFU/g-0.10CFU/g），即樣品中沙門氏菌達到0.75（0.03×25）CFU-2.5（0.10×25）CFU就可能在BPW中增殖并被SureTect實時PCR方法檢出。

表3中所有P值都大于0.05，因此在α=0.05水平，對于所有5類食品類別，兩種方法的相對檢測限都無顯著性差別；5類食品基質對檢測限幾乎沒有影響。

在判斷兩種方法是否一致的檢驗過程中，通常設計四格列聯(lián)表進行X2檢驗，但是當理論頻數(shù)小于5或總觀測頻數(shù)小于30時，X2檢驗不適用，需要采用Fisher確切概率檢驗法。Fisher確切概率檢驗計算繁瑣，本研究采用MATLAB（R2009b版，美國 Mathworks公司）程序運行M文件自動完成檢驗。Fisher確切概率法的M文件下載自http://www.mathworks.cn/matlabcentral/fileexchange/5957-fisherextest。為確保該M文件的準確性，該文件經過驗證后再用于Fisher確切概率檢驗。

3.3 包含性和排他性

根據ISO 16140，包含性是指可替代方法從許多菌株中識別出目標分析物的能力，而排他性是指可替代方法對非目標菌株抗干擾的能力。分別采用SureTect方法和GB 4789.4同時檢測30株沙門氏菌和30株干擾菌獲得該可替代方法的包含性和排他性指標，結果見表4。

表4 SureTect方法的包含性和排他性結果數(shù)據表

除了干擾菌中一株小腸結腸炎耶爾森氏菌Yersinia enterocolitica CMCC52203被SureTect方法檢測為陽性外，兩種方法檢測結果均一致。在檢測工作中，出現(xiàn)假陰性不可接受，會造成“漏檢”；而偶爾出現(xiàn)假陽性可以接受，因其并不影響工作質量，只是增大了檢測工作量。因此，即使結果中出現(xiàn)了一次假陽性，SureTect方法的包含性和排他性也可滿足檢測工作需要。

方法的包含性和排他性與前面提到的方法的準確性、靈敏性和特異性存在著相似性，都是依靠對一定數(shù)量的陽性和陰性樣品進行檢測來判斷檢測方法的性能，體現(xiàn)的是方法識別目標分析物和排除干擾物的能力。但是，包含性和排他性針對的是純培養(yǎng)的菌，而準確性、靈敏性和特異性針對的卻是污染有特定菌株的檢測樣品。

3.4 方法驗證中的條件選擇

3.4.1 沙門氏菌檢測方法驗證中食品基質的選取

沙門氏菌的方法驗證需以人工污染的方式制備樣品，制備樣品時需接種特定濃度的沙門氏菌到食品基質中。對于不同微生物檢測方法的驗證，需要選取不同的食品基質。ISO 16140的附表B.1對各類別（categories）食品的不同種類（types）可能污染的微生物指標做出了歸納，方法驗證時應針對微生物種類優(yōu)先選取其對應的食品類別中推薦的種類。例如，對于沙門氏菌方法驗證，食品基質應選?。ɡㄌ柾鉃槭称奉悇e，括號內為食品種類）：肉（生肉）、禽（生禽）、水產品（生水產品）、果蔬（鮮果蔬、果汁/濃縮汁）、乳品（鮮、凍、發(fā)酵和干制乳品）、巧克力/烘焙產品（低水分、干制的）、其他（調味料、蛋黃醬、蛋品）、動物飼料（混合）。只有選取了附表B.1中所有推薦類別和種類，驗證的方法才能稱其適用于所有食品。本研究選取了前幾類進出口量較大的幾種食品類別為代表進行驗證，驗證結果適用于大多數(shù)食品類別。此外，對于每一類食品類別，必須達到60個樣品才能用于相對準確性、相對特異性和相對靈敏度的分析[7]。

3.4.2 沙門氏菌檢測方法驗證用菌株的選取

用于方法驗證的沙門氏菌應盡可能選取來源于不同菌種保藏機構、不同地域、不同食品基質的不同血清型菌株。多樣的沙門氏菌菌株可以保證驗證的廣泛性。干擾菌株主要包括與沙門氏菌相近的、有較強干擾性的菌株，如志賀氏菌等腸桿菌科細菌和腸桿菌科之外的細菌。在包含性和排他性的驗證試驗中，對于沙門氏菌檢測方法應至少選取30株目標純培養(yǎng)物；而對于其他菌的檢測方法，應至少選取50株目標純培養(yǎng)物[7]。

3.4.3 食品基質污染水平的控制

方法驗證過程中，樣品基質的污染水平受到嚴格控制。對于相對準確性、相對特異性和相對靈敏度的測定，污染水平大約控制在0-10CFU/g[7]，其目的是為了確保預期大約一半的樣品出現(xiàn)陽性結果；如果全部出現(xiàn)陽性結果或者全部出現(xiàn)陰性結果，這些指標將會為0或100%，表明驗證失敗。對于相對檢測限的測定，污染水平應控制達到如下程度：第一個水平是陰性對照（不接種沙門氏菌）；第二個水平是理論上的檢測限（約0.04CFU/g，即25g樣品中存在1CFU）；第三個水平略高于理論檢測限（定為3倍的理論檢測限，約0.12CFU/g）[7]。對于方法的包含性和排他性試驗，目標菌的接種水平最高，確定為待驗證方法相對檢測限的10到100倍[7]。

3.4.4 可替代方法和參照方法步驟不同時的選擇

ISO 16140中規(guī)定：“對同一樣品采用可替代方法和參照方法同時檢測”。對于兩種方法的第一步增菌液相同時，這一規(guī)定可以滿足。本研究中，兩種方法第一步使用的增菌液都是BPW，可以從同一份BPW分別吸取一定體積的增菌液進行后續(xù)分析。然而對于有的檢測項目，第一步使用的增菌液不一致，就無法直接用兩種方法同時檢測同一個樣品。ISO 16140附件D.2給出了解決辦法：對于液體樣品，取2倍檢測用量（例如，50mL）徹底均質后等分成2份再分別按兩種方法的后續(xù)檢測步驟繼續(xù)檢測；而對于非液體樣品，則稱取2倍質量的樣品（例如，50g）加入等量稀釋液（例如，50mL）徹底混勻，然后等分成2份，分別加入兩種不同的增菌液（注意保持正確的增菌液比例），再分別按兩種方法的后續(xù)檢測步驟繼續(xù)檢測。

4 結論

依據ISO 16140，以SureTect沙門氏菌實時PCR檢測方法為例，將其與沙門氏菌國家標準檢測方法進行了實驗室內驗證，兩種方法在相對準確性、相對特異性、相對靈敏度和相對檢測限等指標上無顯著性差異，包含性和排他性也基本一致。本研究詳細展示了沙門氏菌可替代方法實驗室內驗證的具體程序并對驗證程序中關鍵點進行了探討，對于今后類似驗證工作的開展提供了參考。

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