應(yīng)激性高血糖對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

白 莉，賈永平，忽海洋

無論是否伴有糖尿病（DM），急性心肌梗死（AMI）發(fā)病早期血糖水平升高都很常見。在ST 段抬高AMI（STEMI）患者中，應(yīng)激性高血糖（acute hyperglycemia，SHG）發(fā)生率可高達(dá)50%［1］，而 之 前 診 斷 為DM 的 患 者 僅 占20%～25%［2］，一 項(xiàng)Meta分析結(jié)果表明，AMI時SHG 與患者病死率密切相關(guān)［3］，入院血糖已成為院內(nèi)充血性心力衰竭（CHF）和死亡的主要獨(dú)立預(yù)測因子［4］。同時眾多大型臨床研究結(jié)果表明AMI患者合并高血糖時，即使接受抗凝藥物、溶栓藥物和早期冠脈介入治療恢復(fù)血流灌注，其冠脈微循環(huán)障礙、心源性休克和猝死等并發(fā)癥的發(fā)生率均較血糖水平正常的AMI患者顯著增加，而SHG 對機(jī)體發(fā)生心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia／reperfusion injury，MIRI）時缺血期和再灌注期不同時期的影響及機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。本研究采用成年大鼠結(jié)扎冠狀動脈前降支制作心肌缺血／再灌注模型［5］，分別于缺血期和再灌注期靜脈輸注高糖觀察心肌細(xì)胞的損傷程度和心肌梗死面積（IS）變化，進(jìn)而探討心肌缺血再灌注不同時期SHG 發(fā)生與MIRI之間的關(guān)系及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 健康成年SD 大鼠（北京實(shí)驗(yàn)動物中心提供）50只，2月～3月齡，體重250g～300g，正常飲食。乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；微量注射泵（美國Harvard公司）；HX－200動物呼吸機(jī)（成都太萌科技有限公司）；血糖儀（德國羅氏公司）；Evans藍(lán)和氯化三苯基四氮唑（TTc，Sigma公司）。

1.2 MIRI的模型建立 取實(shí)驗(yàn)大鼠稱重，以30g／L戊巴比妥鈉（30mg／kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定于鼠臺，分離頸靜脈以建立靜脈通路，以程控微量注藥泵輸液給藥。行氣管切開，氣管插管行呼吸機(jī)輔助呼吸（呼吸頻率60 次／min，潮氣量20mL／kg，吸呼比1∶2），四肢皮下插入針形電極描記心電圖，沿胸骨左緣第3、4肋間行縱向切口，在左冠狀動脈前降支起始部2mm 處，用6.0 絲線穿過心肌淺層，結(jié)扎阻斷冠脈血流造成心肌缺血，30min后放松聚乙烯管和絲線，以造成再灌注模型。以心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST 段抬高為缺血模型形成，放松后抬高的ST 段下降1／2以上為MIRI造模成功。缺血30min，再灌注3h，再灌注開始后封閉胸腔（排凈胸腔氣體），恢復(fù)動物自主呼吸。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（SHAM）、高糖組（HG）、生理鹽水對照組（CON）、缺血期高糖組（HGI）、再灌注期高糖組（HGR），每組10只。假手術(shù)組和HGI組、HG 組只在左冠狀動脈前降支下穿線不結(jié)扎。HG 組：開始后一次性給予500 g／L葡萄糖1mL 靜脈內(nèi)注射，繼而500g／L 高糖靜脈內(nèi)泵入，持續(xù)3.5h；CON 組：缺血開始后一次性給予生理鹽水1mL 靜脈內(nèi)注射，繼而持續(xù)靜脈內(nèi)泵入，至再灌注結(jié)束；HGI組：缺血開始后一次性給予500g／L葡萄糖1mL靜脈內(nèi)注射，繼而給予500g／L葡萄糖持續(xù)靜脈內(nèi)泵入，再灌注開始后給予生理鹽水靜脈內(nèi)泵入直至再灌注結(jié)束；HGR 組：缺血開始后給予生理鹽水靜脈輸注，再灌注開始后一次性給予500g／L葡萄糖1mL靜脈注射，繼而給予500g／L葡萄糖持續(xù)靜脈內(nèi)泵入，至再灌注結(jié)束。各組靜脈輸液速度均為4mL／（kg·h）。

1.4 檢測指標(biāo) 分別于缺血前、缺血后25min、再灌注1.5h和3h從尾靜脈取血，用血糖儀測血糖水平。再灌注結(jié)束后，打開腹腔，由腹主動脈取血3mL，常溫放置2 0min后，3 0 0 0 r／min，離心5min，取血清300μL進(jìn)行檢測。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作檢測LDH 水平。

1.5 伊文氏藍(lán)－TTC雙染法測定IS 再灌注3h結(jié)束后再次原位阻斷冠狀動脈血流，2%伊文氏藍(lán)4mL 由頸動脈注入后迅速分布全身，迅速將心臟剪下，4 ℃生理鹽水清洗后凍存于－20℃冰箱。1h后用心臟切片器垂直于心臟長軸將其切成1 mm厚的薄片，置于1%TTC（pH 7.4）溶液中，37 ℃孵育15min后置于4%的甲醛溶液過夜。次日，將已染色的心肌薄片按順序放置于平板上，用配備有微焦距鏡頭的數(shù)碼相機(jī)拍照，并輸入計算機(jī)。采用單盲法分別將伊文藍(lán)染色區(qū)（藍(lán)染，非缺血區(qū)）、TTC染色區(qū)（紅染，缺血區(qū)）以及非TTC染色區(qū)（白色，梗死區(qū)）用Image Pro Plus面積測算軟件進(jìn)行計算處理。總?cè)毖娣e以缺血區(qū)面積（AAR）占左室（LV）面積百分比表示（AAR／LV×100%），IS以心臟梗死范圍（INF）占缺血區(qū)面積（AAR）的百分比表示（INF／AAR×100%）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 以SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用One－Way ANOVA 分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心肌缺血再灌注模型的制備 本實(shí)驗(yàn)采用戊巴比妥腹腔麻醉效果好，輔以合適的呼吸參數(shù)及穩(wěn)定的呼吸機(jī)性能，術(shù)中呼吸道分泌物少，無麻醉意外發(fā)生?？傆?0 只大鼠，SHAM組及HG 組大鼠全部存活，CON 組大鼠死亡1 只，HGI組大鼠死亡3只，HGR 組大鼠死亡2 只，死亡的原因主要是嚴(yán)重的心律失常、分泌物呼吸道梗阻等。

2.2 各組血糖水平變化 缺血前各組間血糖水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；CON 組在缺血期血糖水平均略有降低，再灌注期血糖水平均略有升高，但兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。靜脈輸注高糖后，血糖水平迅速升高，與CON 組相比，HGI組缺血期血糖水平顯著升高（P＜0.05），再灌注期血糖水平逐漸下降。與CON 組相比，HGR 組再灌注期血糖水平顯著升高（P＜0.05）。詳見表1。

表1 不同時間點(diǎn)各組的血糖水平mmol／L

表1 不同時間點(diǎn)各組的血糖水平mmol／L

與SHAM 組相比，1）P＜0.01；與CON 組相比，2）P＜0.01。

組別 缺血前 缺血25min 再灌注1.5h 再灌注3h SHAN 組5.1±0.7 4.9±0.6 5.2±0.4 5.3±0.4 HG 組 5.0±0.5 11.3±0.91） 11.1±0.61） 11.2±0.41）CON 組 4.9±0.4 4.8±0.3 4.9±0.2 5.1±0.3 HGI組 4.6±0.5 18.1±0.91）2） 8.7±0.61）2） 6.5±0.41）2）HGR 組 5.3±0.5 5.0±0.4 18.4±0.81）2） 19.1±0.71）2）

2.3 心肌酶譜檢測結(jié)果 HG 組與SHAM 組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；MIRI各組LDH 水平顯著高于SHAM 組，其中CON 組 是SHAM 組 的2.65 倍，HGI 組、HGR 組 分 別 為SHAM 組的3.41倍和2.81倍；與CON 組相比，HGI組LDH水平為1.29倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而HGR 組與CON 組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 不同處理組大鼠血清LDH 水平比較U／L

表2 不同處理組大鼠血清LDH 水平比較U／L

與SHAM 組相比，1）P＜0.01；與CON 組相比，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

2.4 不同處理組大鼠MIRI后IS比較 應(yīng)激性高血糖可加重心肌細(xì)胞凋亡，擴(kuò)大心肌梗死面積。CON 組、HGI組和HGR組間總?cè)毖秶町悷o統(tǒng)計學(xué)意義。大鼠發(fā)生MIRI時心臟出現(xiàn)明顯的梗死區(qū)。與CON 組相比，HGI組的IS 明顯擴(kuò)大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而HGR 組IS與CON 組相比略增大，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表3。

表3 不同處理組大鼠MIRI后IS比較 %

表3 不同處理組大鼠MIRI后IS比較 %

與CON 組相比，2）P＜0.01。

組別IS CON 組36.53±3.06 HGI組 46.93±3.521）HGR 組 38.50±2.71

3 討 論

大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，無論患者既往有無糖尿病，只要AMI時合并有高血糖存在，即使溶栓、介入等技術(shù)手段可以及時疏通閉塞血管實(shí)現(xiàn)缺血心肌的再灌注，心力衰竭及死亡的發(fā)生率依然顯著高于正常血糖患者［6］。Lavi等［7］研究證實(shí)，STEMI患者即使接受PCI治療，其入院血糖水平和院內(nèi)死亡率呈顯著正相關(guān)，急性高血糖仍是預(yù)后不佳的強(qiáng)烈預(yù)測因子。而發(fā)生急性高血糖的患者中，只有20%～25%既往有糖尿病史，這顯然不能完全靠糖尿病引起動脈粥樣硬化程度加重來解釋，高血糖可能直接增加了心肌自身對MIRI的敏感性，導(dǎo)致?lián)p傷加重。目前研究普遍認(rèn)為，AMI并發(fā)SHG 的主要機(jī)制是機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)致神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的全面激活及存在潛在的糖代謝紊亂［8］。

當(dāng)細(xì)胞受損后，細(xì)胞內(nèi)的LDH 漏出到細(xì)胞外，因此本實(shí)驗(yàn)通過測定血清中LDH 活性反映心肌細(xì)胞損傷的程度，同時采用伊文氏藍(lán)－TTC雙染法測定心肌梗死面積以明確不同時期的高血糖是否增加MIRI。在實(shí)驗(yàn)中，與SHAM 組相比，HG 組LDH 水平升高不明顯，而行MIRI各組大鼠LDH 水平明顯升高，IS擴(kuò)大，其中HGI大鼠的LDH 活性最高，IS最大，HGR 組的LDH 水平及IS與CON 組比較差異統(tǒng)計學(xué)意義。這說明單獨(dú)高糖刺激并不能引起心肌細(xì)胞的明顯損傷，靜脈輸注高糖后，AMI大鼠心肌對MIRI的敏感性升高，缺血期的高血糖會造成更嚴(yán)重的心肌損傷。提示缺血期和再灌注期高血糖對心肌細(xì)胞損傷的影響或機(jī)體對抗應(yīng)激的機(jī)制和反應(yīng)過程不同。已有大量實(shí)驗(yàn)證明快速血糖升高會產(chǎn)生強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)［9］。而急性高血糖和MIRI可以通過線粒體誘發(fā)活性氧（ROS）的爆發(fā)性產(chǎn)生，過度的ROS生成觸發(fā)不同的細(xì)胞功能障礙，包括脂質(zhì)過氧化，DNA 突變，及細(xì)胞凋亡或壞死［10］，當(dāng)ROS的產(chǎn)生超過機(jī)體的清除能力，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡，致細(xì)胞凋亡增加。推測缺血期SHG 誘發(fā)的增強(qiáng)的氧化應(yīng)激可能會影響心肌細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，進(jìn)而削弱其抗氧化抗凋亡功能，造成更嚴(yán)重的心肌損傷。同時，高血糖可加重炎癥反應(yīng)，致血管內(nèi)皮功能紊亂，引起內(nèi)皮依賴性血管舒張功能減退及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［11］。心肌梗死大小更多地取決于細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度，隨著缺血期血糖升高，心肌細(xì)胞缺血、缺氧加重，致使再灌注期冠脈微循環(huán)障礙發(fā)生率更高，并發(fā)致死性心律失常的幾率明顯增加［12］，表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)中HGI組IS進(jìn)一步擴(kuò)大，并有3只大鼠死于惡性心律失常。

本研究發(fā)現(xiàn)缺血期高血糖可以增加大鼠心肌對MIRI的易感性而加重MIRI，這可能與高糖誘發(fā)的氧化應(yīng)激效應(yīng)加重MIRI大鼠活性氧的產(chǎn)生、高凝狀態(tài)、內(nèi)皮功能不全，以及加重炎癥反應(yīng)，致心肌氧化還原失衡等有關(guān)，進(jìn)而影響冠脈舒張，加重再灌注期微循環(huán)障礙，使凋亡加重。但本實(shí)驗(yàn)未探討MIRI發(fā)生SHG 時機(jī)體的抗氧劑系統(tǒng)的活性以及應(yīng)對氧化應(yīng)激的機(jī)制，從而在臨床上可以有針對性地采取干預(yù)措施，降低SHG 對MIRI的危害，改善預(yù)后。

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