溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子的合成及穩(wěn)定性研究

趙亞利，楊濤，張英，高紅云，席亞楠

（河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002）

·基礎(chǔ)研究·

溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子的合成及穩(wěn)定性研究

趙亞利，楊濤，張英，高紅云，席亞楠

（河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002）

目的 使用蛋白質(zhì)做穩(wěn)定劑來合成銀納米粒子，并探討其穩(wěn)定性，為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域及日常生活中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。 方法 采用化學(xué)還原法一步合成溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子，改變穩(wěn)定性影響因素并觀察銀納米溶膠的變化。即加入不同濃度的氯化鈉來改變銀納米溶膠的離子強(qiáng)度，用酸或堿來調(diào)節(jié)溶膠pH，對溶膠進(jìn)行多次冷凍-解凍循環(huán)。并且用檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子做對照試驗(yàn)。 結(jié)果 溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子對離子強(qiáng)度的變化比較敏感，在10 mmol/L NaCl條件下完全沉淀；在酸性條件下能夠穩(wěn)定存在（pH≤6）；冷凍-解凍循環(huán)對其穩(wěn)定性影響比較小。 結(jié)論 溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子的穩(wěn)定性受周圍環(huán)境影響較大，在使用及儲(chǔ)存時(shí)需要加以注意。

銀納米粒子；溶菌酶；穩(wěn)定性

隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，納米粒子在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域及人們?nèi)粘Ｉ钪械膽?yīng)用越來越廣泛[1]。銀納米粒子具有很強(qiáng)的抗菌抗病毒性能，對常見細(xì)菌（如大腸桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌以及其他革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌等[2]）以及HBV[3]、HIV[4]等都有良好的抑制效果，并且銀納米粒子屬于非抗生素類殺菌劑，無耐藥性，因此含有銀納米粒子醫(yī)療器械的應(yīng)用越來越廣泛，如抗菌導(dǎo)管、敷料、宮內(nèi)節(jié)育器等[5-7]。合成銀納米粒子成為研究者們的興趣所在。銀納米粒子的合成方法有光化學(xué)法[8]、電化學(xué)法[9]、熱化學(xué)法[10]、化學(xué)還原法[11]、生物化學(xué)法[12]等，其中通過還原金屬鹽制備金屬納米粒子是比較簡單、常用的方法。銀納米粒子具有很高的表面能，很容易聚集，通常需要加入穩(wěn)定劑來獲得分散性良好的銀納米粒子膠體溶液[13]。溶菌酶是一種常見的蛋白質(zhì)，在醫(yī)學(xué)上可作為一種天然抗感染物質(zhì)，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，臨床上可用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔潰瘍、水痘、帶狀皰疹和扁平疣等的治療[14]。多種細(xì)胞及分泌物中均含有溶菌酶，如胎盤、脾臟、唾液、血漿、尿、乳汁等體液以及蛋清、牛奶、微生物等[15]。已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道過利用蛋清溶菌酶作為還原劑，在甲醇溶液中合成具有抗菌活性的銀納米粒子[16]，但是合成條件需要較長時(shí)間的光照射，而且銀納米粒子轉(zhuǎn)移到水溶液中的過程較繁瑣。在此，使用溶菌酶做穩(wěn)定劑，通過硼氫化鈉還原硝酸銀，方便快捷地制得了溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子膠體溶液。溶菌酶的存在增強(qiáng)了銀納米粒子的穩(wěn)定性，而溶菌酶作為生物分子，與銀納米粒子相結(jié)合有可能會(huì)提高銀納米粒子的生物相容性。溶菌酶的量對銀納米粒子的穩(wěn)定性有顯著影響。此外，一些與銀納米粒子的使用或儲(chǔ)存等相關(guān)的常見因素，如離子強(qiáng)度、pH以及冷凍-解凍循環(huán)等，對銀納米粒子的穩(wěn)定性也有不同程度的影響，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中用檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子做對照。對銀納米粒子穩(wěn)定性的研究有助于擴(kuò)大其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以及人們?nèi)粘Ｉ钪械膽?yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試劑

硝酸銀（AgNO3）、硼氫化鈉（NaBH4）和3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）購自百靈威科技有限公司。雞蛋白溶菌酶（凍干粉末）購自Sigma公司。檸檬酸三鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸均為分析純試劑。實(shí)驗(yàn)所用水為Milli-Q體系純化的超純水（＞18.0 MΩ）。

1.2 儀器設(shè)備

原子力顯微鏡（AFM）成像使用美國Agilent公司的5500型掃描探針顯微鏡，在室溫大氣環(huán)境下采用AC模式進(jìn)行，掃描速度為1.0 line/s，AFM圖像經(jīng)過二階平滑處理。紫外-可見吸收光譜測試在日本島津UV-2550分光光度計(jì)上進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中的照片使用SAMSUNG數(shù)碼相機(jī)拍攝。

1.3 銀納米粒子的合成

溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子的合成方法如下：（1）10 mL 0.2 mmol/L溶菌酶與200 μL 10 mmol/L AgNO3溶液混合均勻（Ag+與溶菌酶摩爾比為1∶1），在劇烈攪拌下逐滴加入80 μL 100 mmol/L NaBH4溶液。制得銀納米膠體溶液（A）。（2）保持AgNO3的量不變，將Ag+與溶菌酶摩爾比變?yōu)?∶1，制備銀納米膠體溶液（B）。

通過改進(jìn)Jana報(bào)道的合成銀晶種的方法[17]來制備檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子膠體溶液，具體步驟為：9.5 mL H2O與250 μL 10 mmol/L 檸檬酸三鈉、250 μL 10 mmol/L AgNO3混合均勻，在劇烈攪拌下逐滴加入300 μL 10 mmol/L NaBH4溶液，攪拌30 s后停止。

1.4 穩(wěn)定性影響實(shí)驗(yàn)

1.4.1 離子強(qiáng)度影響

向1 mL銀納米溶膠中加入200 μL不同濃度的NaCl溶液，混合均勻，4 ℃下儲(chǔ)存，24 h后觀察現(xiàn)象。

1.4.2 pH影響

制備好的溶菌酶穩(wěn)定的和檸檬酸穩(wěn)定的銀納米溶膠的pH均約為6。將等體積不同濃度的HCl或NaOH溶液加入到銀納米溶膠中，調(diào)節(jié)其pH值，觀察pH變化對銀納米溶膠穩(wěn)定性的影響。

1.4.3 冷凍-解凍循環(huán)影響

各取1 mL制備好的銀納米溶膠于2 mL離心管中，在-20 ℃下冷凍1 h，然后在室溫下解凍，此為冷凍-解凍循環(huán)1次。溶菌酶穩(wěn)定的銀納米溶膠的冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)分別為1、2、5、8和10次；檸檬酸穩(wěn)定的銀納米溶膠的冷凍-解凍次數(shù)分別為1、2、3、4和5次。

1.5 原子力顯微鏡（AFM）表征實(shí)驗(yàn)的樣品制備

將溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子膠體溶液稀釋一倍，取50 μL滴加到新解離的云母片上，30 min后用超純水清洗云母表面3次，在室溫下干燥器內(nèi)充分干燥。制備檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子的AFM表征樣品時(shí)，首先將云母片進(jìn)行APTES功能化，即滴加15 μL 0.05 % (V/V)的APTES到新解離的云母表面上，10 min后用超純水清洗表面3次，再用N2吹干。將檸檬酸穩(wěn)定的銀納米膠體溶液稀釋兩倍，然后將APTES功能化的云母片浸泡到1 mL該溶液中，30 min后用超純水清洗3次，在室溫下干燥器內(nèi)充分干燥。

2 結(jié)果

2.1 銀納米粒子的表征

Ag+與溶菌酶初始摩爾比為1∶1時(shí)，經(jīng)過NaBH4還原得到的是棕黃色澄清銀納米粒子膠體溶液（A），而當(dāng)初始摩爾比變?yōu)?∶1時(shí)，得到的灰綠色銀納米粒子溶液（B）在5 min內(nèi)完全沉淀。溶液（A）的等離子體共振吸收峰在414 nm處，溶液（B）的上清液吸光度為零，如圖1所示。制備的溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子為球形顆粒，分布較均勻，平均粒徑為（2.51±0.67） nm，如圖2所示。Ag+與檸檬酸三鈉的初始摩爾比為1∶1時(shí)，制得的檸檬酸穩(wěn)定的銀納米溶膠為金黃色澄清溶液，等離子體共振吸收峰在392 nm處。如圖3所示。檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子也為球形顆粒，平均粒徑為（6.02±1.42） nm。如圖4所示。

圖1 溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子的照片及紫外-可見吸收光譜

圖2 溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子的AFM圖及粒徑統(tǒng)計(jì)

圖3 檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子的照片及紫外-可見吸收光譜

圖4 檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子的AFM圖及粒徑統(tǒng)計(jì)

2.2 離子強(qiáng)度對銀納米粒子穩(wěn)定性的影響

溶菌酶穩(wěn)定的銀納米溶膠中加入10 mmol/L NaCl后，在24 h內(nèi)完全沉淀，溶膠顏色從棕黃色變?yōu)闊o色，紫外-可見吸收光譜顯示，吸光度從1.25降為0.07，進(jìn)一步證明澄清的上清液中幾乎已經(jīng)沒有銀納米粒子存在。而檸檬酸穩(wěn)定的銀納米溶膠顏色隨NaCl濃度的增加逐漸變淺直至無色，吸光度隨之逐漸降低，最大吸收波長略微紅移。當(dāng)NaCl濃度增加到40 mmol/L時(shí)，銀納米粒子完全從溶液中沉降出來，上清液澄清透明，吸光度為零。如圖5所示。

圖5 不同NaCl濃度對溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子（左）和檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子（右）穩(wěn)定性影響的照片及紫外-可見吸收光譜

2.3 pH對銀納米粒子穩(wěn)定性的影響

在酸性條件下，溶菌酶穩(wěn)定的銀納米溶膠的顏色仍為棕黃色且溶液的分散狀態(tài)幾乎沒有變化。pH 7～9完全沉淀，而pH 10～11膠體溶液在外觀上與原始溶液沒有明顯差別，但相應(yīng)的吸光度有所下降。當(dāng)pH≥12時(shí)，膠體溶液的顏色明顯變淺，呈灰色，吸光度幾乎為零。檸檬酸穩(wěn)定的銀納米溶膠的pH約為6，隨著酸度的增加，溶膠顏色逐漸變淺，吸光度逐漸降低直至為零。而pH 7～12溶液顏色比初始狀態(tài)更加明顯，呈亮金黃色，紫外-可見吸收光譜曲線幾乎重合，吸光度有所增大且最大吸收波長略微紅移。如圖6所示。

圖6 不同pH條件下溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子（左）和檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子（右）的照片及紫外-可見吸收光譜

2.4 冷凍-解凍循環(huán)對銀納米粒子穩(wěn)定性的影響

經(jīng)過多次冷凍-解凍循環(huán)后，溶菌酶穩(wěn)定的銀納米溶膠仍為棕黃色澄清溶液，而紫外-可見吸收光譜顯示，隨著冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)的增加，銀納米粒子的吸光度有逐漸降低趨勢。檸檬酸根穩(wěn)定的銀納米粒子，經(jīng)過1次冷凍-解凍循環(huán)后，溶液顏色從金黃色立即變成橙黃色，隨著循環(huán)次數(shù)的增多，溶膠顏色漸變成橙紅色、淺紅色并趨向灰色。紫外-可見吸收光譜顯示，銀納米粒子的吸光度隨著冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)的增加而快速降低。如圖7所示。

圖7 不同冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)對溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子（左）和檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子（右）穩(wěn)定性影響的照片及紫外-可見吸收光譜

3 討論

本文首次使用溶菌酶作為穩(wěn)定劑，通過NaBH4還原成功制備了分散性良好的銀納米粒子膠體溶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示減少穩(wěn)定劑用量后得到的銀納米溶膠不能穩(wěn)定存在，說明穩(wěn)定劑的量對膠體溶液的穩(wěn)定性至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)使用最常用穩(wěn)定劑——檸檬酸三鈉，來對比溶菌酶對銀納米粒子的穩(wěn)定效果。對于粒徑小于25 nm的銀納米粒子，由于內(nèi)在尺寸效應(yīng)，納米粒子的增大會(huì)引起SPR峰的藍(lán)移[7,18]，因此比較圖1與圖3的紫外-可見吸收光譜曲線，可以推測檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子的粒徑比溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子的粒徑要大。結(jié)果顯示檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子的平均粒徑比溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子的平均粒徑大3.51 nm左右，與紫外-可見吸收光譜數(shù)據(jù)相符。比較圖2與圖4，可以看出，溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子比檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子的粒徑分布更窄，尺寸更加均勻。因此，溶菌酶不僅可以有效地穩(wěn)定銀納米粒子，而且比傳統(tǒng)穩(wěn)定劑（檸檬酸）有更強(qiáng)的控制銀納米粒子尺寸的能力。

溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子在10 mmol/L NaCl條件下完全沉淀，而檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子在30 mmol/L范圍內(nèi)溶膠狀態(tài)變化不大，由此可見，溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子對離子強(qiáng)度變化的忍耐能力不如檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子強(qiáng)。NaCl對銀納米粒子的沉降機(jī)理可能與不同的穩(wěn)定劑有關(guān)。銀納米粒子與溶菌酶形成的生物共軛體中，溶菌酶的氨基結(jié)合到銀納米粒子的表面上[19]，在酸性條件下，氨基的質(zhì)子化使得銀納米粒子表面帶有正電荷，加入NaCl后，Cl-中和掉部分正電荷，導(dǎo)致靜電層的厚度減小，粒子-粒子間的相互作用增強(qiáng)，從而導(dǎo)致粒子聚集和沉降程度增加[20]。檸檬酸穩(wěn)定的銀納米溶膠中加入NaCl后，銀納米粒子表面上的檸檬酸根與Na+相互作用，導(dǎo)致銀納米粒子表面的裸露程度增加[21]，從而相互聚集，不能穩(wěn)定存在。

溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子在酸性條件下可以很穩(wěn)定地存在，這可能與溶菌酶的性質(zhì)有關(guān)，溶菌酶在酸性條件下比較穩(wěn)定，pH大于7時(shí)酶活性急劇下降[14]，從而不能很好地穩(wěn)定銀納米粒子。檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子的耐酸性不如溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子強(qiáng)，這可能是因?yàn)樵诮行曰驂A性條件下，檸檬酸根的羧基結(jié)合在銀納米粒子表面上，粒子間通過靜電斥力而穩(wěn)定存在。檸檬酸的pKa1、pKa2、pKa3值分別為3.13、4.76、6.40，隨著酸度的增加，銀納米粒子表面上的檸檬酸根逐漸被質(zhì)子化，導(dǎo)致粒子間的范德華斥力減小，引力增加，粒子逐漸聚集。因此，在酸性條件下，溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子能夠穩(wěn)定存在，酸度變化不會(huì)影響銀納米粒子溶膠的顏色和狀態(tài)，擴(kuò)大了在酸性條件下的應(yīng)用范圍。

冷凍-解凍循環(huán)與物質(zhì)的儲(chǔ)存與再用密切相關(guān)，相比于檸檬酸穩(wěn)定的銀納米粒子，冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)對溶菌酶穩(wěn)定的銀納米溶膠的影響較小。這可能是因?yàn)樵?20 ℃冷凍過程中溶菌酶的結(jié)構(gòu)沒有遭到破壞，從而能夠較好地保護(hù)銀納米粒子。檸檬酸作為離子化合物，對溫度變化的承受力較差，這突出說明了蛋白質(zhì)作為穩(wěn)定劑的優(yōu)勢。

綜上所述，生物分子溶菌酶作為銀納米粒子的穩(wěn)定劑，增強(qiáng)了銀納米粒子的穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)方法（以檸檬酸為穩(wěn)定劑）相比，溶菌酶穩(wěn)定的銀納米粒子對離子強(qiáng)度變化比較敏感，在酸性條件下能夠穩(wěn)定，受冷凍-解凍循環(huán)影響較小。對銀納米粒子穩(wěn)定性的研究可以為銀納米粒子在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域及日常生活中的應(yīng)用提供一定的理論指導(dǎo)。

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（責(zé)任編輯：劉俊華）

Study on the preparation and stability of the lysozyme-stabilized silver nanoparticles

ZHAO Yali, YANG Tao, ZHANG Ying, GAO Hongyun, XI Yanan
(College of Chemistry and Environmental Science, Hebei University, Baoding 071002, China)

Objective We have synthesized silver nanoparticles using protein as the stabilizer and discussed their stability to provide theoretical guidance for their application in biomedical field and daily life. Methods We have presented a one-step approach of chemical reduction to prepare the lysozyme-stabilized silver nanoparticles. Results The stability of lysozyme-stabilized silver nanoparticles was sensitive to the change of ionic strength and the nanoparticles precipitated completely in 10 mmol/L NaCl. The lysozyme-stabilized silver nanoparticles were stable under acidic condition (pH≤6). And the freeze-thawing cycle had a little influence on their stability. Conclusion The stability of lysozyme-stabilized silver nanoparticles is greatly influenced by the surrounding conditions. The variation caused by the stability factors should be considered for use and storage of the lysozyme-stabilized silver nanoparticles.

silver nanoparticles; lysozyme; stability

O648

A

1674-490X(2014)04-0001-07

2014-07-02

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（B2011201107）；河北大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目基金（2009-172）

趙亞利（1988—），女，河北石家莊人，在讀碩士。

楊濤（1977—），男，陜西西安人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事生物大分子和納米材料的相互作用研究和掃描探針成像分析。E-mail: tyang@hbu.edu.cn