加熱和冷卻速率對(duì)大豆蛋白凝膠特性的影響

武 肖 傅玉穎 潘偉春 關(guān)鵬翔 盧錦麗

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310035)

各種來源的球蛋白因其良好的營養(yǎng)價(jià)值和對(duì)食品質(zhì)構(gòu)的影響在食品工業(yè)中具有重要的作用［1］。這種質(zhì)構(gòu)特性由蛋白質(zhì)交聯(lián)形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)決定，所以凝膠作為球蛋白的一種非常重要的功能特性常用來改善食品質(zhì)構(gòu)［2］。蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到多種外部因素影響。理論上，pH、離子強(qiáng)度、加熱溫度和加熱速率是影響球蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的重要因素［3－5］;現(xiàn)實(shí)中，他們也是食品工業(yè)中用來調(diào)控蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)的常用加工參數(shù)。

小變形振蕩(動(dòng)態(tài))流變測(cè)試是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)凝膠性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的一種非常有效的方法，它對(duì)樣品物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成的改變極其敏感，非常適合考查凝膠形成過程中的一些微小變化［6－7］。高儲(chǔ)能模量表示分子間有更多的相互作用和很強(qiáng)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而低的tanδ表示更好的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［8］。

目前，大量研究集中于pH、離子強(qiáng)度和溫度對(duì)蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)的影響，而加熱和冷卻速率對(duì)蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)和性質(zhì)影響的報(bào)道較少，特別是冷卻階段對(duì)蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)和性質(zhì)具有很大的影響。Sun等［9］發(fā)現(xiàn)慢的加熱速率對(duì)豌豆球蛋白凝膠有不利的影響，而較慢的冷卻速率能夠增加蛋白質(zhì)凝膠的強(qiáng)度。本試驗(yàn)意在探討加熱和冷卻速率對(duì)大豆蛋白熱誘導(dǎo)凝膠特性的影響，以期為大豆蛋白的開發(fā)利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕:山東萬得福集團(tuán)實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

安東帕MCR 302流變儀:奧地利安東帕(中國)有限公司;高速冷凍離心機(jī)(H1850R型):湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;pH計(jì)(PHS－3C型):上海理達(dá)儀器廠;冷凍干燥機(jī)(FD－1C－50型):北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;半微量凱氏定氮儀(KJ2300型):福斯中國有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

采用堿溶酸沉法制備大豆分離蛋白(SPI)，將低溫脫脂豆粕按1∶15的比例與去離子水混合，室溫?cái)嚢? h后9 710 r/min離心30 min，取上清液用1 mol/L HCl調(diào)pH至4.5(等電點(diǎn))，4℃下靜置2 h后8 690 r/min離心10 min，取蛋白凝乳重新溶于去離子水中，1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至中性，然后以9 710 r/min下離心30 min除去少量不溶物，透析48 h后冷凍干燥。測(cè)其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92.5%(N×6.25)。

1.3.2 流變分析

將SPI溶于去離子水中配成12%的溶液，充分溶解后，使用流變儀進(jìn)行動(dòng)態(tài)振蕩分析，所用轉(zhuǎn)子為同軸圓筒雙間隙(型號(hào):DG26.7)，約5 mL樣品倒入圓筒中，待轉(zhuǎn)子到達(dá)測(cè)量部位時(shí)，在樣品表面滴加少許硅油以防水分揮發(fā)。

分析測(cè)試程序:樣品在25℃下平衡2 min，溫度范圍25℃～95℃～25℃(從室溫到95℃，足夠使大豆蛋白變性且常用于食品工業(yè)中)，加熱和冷卻速率分別為 4、2、1、0.5 ℃ /min，應(yīng)變?yōu)?1%，頻率 1 Hz。隨后對(duì)樣品進(jìn)行頻率掃描:25℃下0.01～10 Hz。收集每個(gè)樣品儲(chǔ)能模量(G')、耗能模量(G″)和 tanδ(G″/G')，取1 Hz時(shí)數(shù)據(jù)比較形成凝膠的特性。所設(shè)應(yīng)變值在熱誘導(dǎo)蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的線性黏彈區(qū)內(nèi)(預(yù)試驗(yàn)所得)。每個(gè)樣品測(cè)3次。

凝膠點(diǎn)是凝膠開始形成時(shí)的溫度，本試驗(yàn)采用加熱階段G'快速增加時(shí)G'與G″交點(diǎn)的溫度作為大豆蛋白的凝膠點(diǎn)。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，采用SPSS軟件進(jìn)行分析，測(cè)定結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ANOVA和Duncan分析(95%置信區(qū)間)。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆蛋白典型凝膠形成模型

大豆蛋白典型的熱誘導(dǎo)凝膠形成曲線見圖1，每個(gè)樣品測(cè)試(3次)獲得的流變圖譜從本質(zhì)上來說是完全一致的。從圖1中的3個(gè)參數(shù)(G'、G″、tanδ)可以看出大豆蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成過程中流變性質(zhì)的改變。G'表示蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的彈性組成，代表了凝膠結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度，對(duì)凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有貢獻(xiàn);G″表示黏性組成，對(duì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)沒有貢獻(xiàn)。Tanδ值象征著網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的類型，其值越小代表三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越好。

圖1a可以看出，在加熱階段溫度升至80℃前G'和G″基本保持恒定。在此過程中，蛋白質(zhì)分子逐漸變性(去折疊)、疏水基團(tuán)暴露是凝膠形成的準(zhǔn)備階段。當(dāng)加熱溫度超過85℃后，G'和G″快速上升表明凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐步形成。凝膠過程初始階段黏性行為占主導(dǎo)地位(G″＞G')，而在加熱后期彈性行為占據(jù)主導(dǎo)地位(G'＞G″)，此時(shí)蛋白質(zhì)分子聚集并且交聯(lián)形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，此過程為初始凝膠階段;當(dāng)溫度達(dá)到最高95℃后，冷卻階段開始。在此過程中，G'和G″繼續(xù)穩(wěn)定增加，說明蛋白質(zhì)分子繼續(xù)交聯(lián)、凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)緩慢形成和重排。Paulson等［10］把油菜蛋白凝膠的形成和穩(wěn)定性歸因于疏水相互作用和氫鍵。因此，可以認(rèn)為疏水相互作用和氫鍵對(duì)大豆蛋白凝膠的形成和穩(wěn)定性起到同樣作用。Tanδ是辨別凝膠構(gòu)造的一個(gè)非常重要的參數(shù)。從圖1b可以看出，在85℃之前tanδ逐漸下降，在90℃左右時(shí)急劇下降至一個(gè)非常低的水平，并且在以后的加熱和冷卻階段保持恒定。這說明在冷卻初始階段大豆蛋白溶液已經(jīng)形成了穩(wěn)定的凝膠，并且在冷卻過程中同時(shí)增加了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的彈性和黏性組成。

圖1 典型的大豆蛋白凝膠形成G'，G″模形圖和tanδ模型圖

圖1所示凝膠過程遵循球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠3步過程:1):蛋白變性以及疏水基團(tuán)暴露;2)去折疊的蛋白質(zhì)分子間相互作用(聚集);3)聚集體交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。特別強(qiáng)調(diào)的是在冷卻階段，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)繼續(xù)發(fā)展并且被形成的許多短程鍵(如氫鍵)加強(qiáng)。因此，可以總結(jié)大豆蛋白溶液凝膠網(wǎng)絡(luò)形成主要是疏水相互作用和氫鍵。

對(duì)于所有的加熱和冷卻速率，加熱階段所得的流變曲線基本相同，G'和 G″都小于1 Pa，且 G'＜ G″直到到達(dá)凝膠點(diǎn)(圖1)。所以比較加熱和冷卻速率對(duì)冷卻階段大豆蛋白凝膠性質(zhì)的影響。

2.2 加熱速率對(duì)冷卻階段凝膠形成G'值的影響

從圖2a可以看出，在冷卻速率均為2℃/min的情況下，加熱速率越慢，冷卻階段形成的凝膠G'值越大。這可以解釋為在相同冷卻速率下，較慢的加熱速率使大豆蛋白分子有更多的時(shí)間去重排和交聯(lián)形成更有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)來增加凝膠強(qiáng)度。這與前述Sun等［9］的研究結(jié)論不同，他們發(fā)現(xiàn)慢的加熱速率對(duì)豌豆蛋白凝膠形成有不利的影響，這種差異可能是不同的蛋白種類造成的。

圖2 不同加熱和冷卻速率對(duì)冷卻階段大豆蛋白溶液的影響

圖3a表示不同加熱速率下熱誘導(dǎo)大豆蛋白凝膠的性質(zhì)。較慢加熱速率(0.5、1℃/min)的G'顯著大于較快加熱速率(2、4℃/min)下形成凝膠的G'值，4℃/min時(shí)tanδ顯著高于其他較慢加熱速率時(shí)的值。Renkema等［11］認(rèn)為不同的加熱速率影響蛋白質(zhì)的聚集動(dòng)力學(xué)導(dǎo)致產(chǎn)生不同網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(不同粗細(xì)的線股、孔隙等)的凝膠，而不同的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)又導(dǎo)致不同的G'值。

圖3 12%大豆蛋白凝膠形成后頻率掃描1 Hz時(shí)熱誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)

2.3 冷卻速率對(duì)冷卻階段凝膠形成G'的影響

圖2b表示冷卻速率對(duì)大豆蛋白凝膠形成的影響。在相同加熱速率下，最慢的冷卻速率(0.5℃/min)時(shí)大豆蛋白形成最強(qiáng)的凝膠強(qiáng)度。這是因?yàn)槁睦鋮s速率使蛋白質(zhì)分子有更長的時(shí)間處于去折疊態(tài)，放緩了暴露基團(tuán)的活動(dòng)性，使其在蛋白質(zhì)分子相互作用前達(dá)到最佳的排列。氫鍵是促進(jìn)大豆蛋白凝膠結(jié)構(gòu)形成的重要因素，較低的溫度則有利于氫鍵的形成，因此可以推測(cè)慢的冷卻速率促進(jìn)氫鍵的形成從而產(chǎn)生更強(qiáng)的凝膠。O'Kane等［12］報(bào)道在慢的冷卻速率(0.2℃/min)下疏水作用和二硫鍵與豌豆蛋白的凝膠結(jié)構(gòu)有關(guān)，他們認(rèn)為慢的冷卻速率為巰基基團(tuán)反應(yīng)形成二硫鍵提供了充足的時(shí)間，凝膠強(qiáng)度增加。眾所周知，親水性氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的側(cè)鏈上極性基團(tuán)可以形成氫鍵并且為去折疊蛋白質(zhì)分子提供鏈接。對(duì)于疏水相互作用，非極性氨基酸如丙氨酸、甘氨酸等在球蛋白變性時(shí)從分子內(nèi)部暴露出來而更容易形成。

圖3b表示冷卻速率對(duì)熱誘導(dǎo)大豆蛋白凝膠性質(zhì)的影響。隨著冷卻速率的增大，G'值減少。Tanδ在較慢冷卻速率時(shí)(0.5、1、2℃/min)和快速冷卻速率時(shí)(4℃/min)有顯著不同。這是因?yàn)樵诶鋮s階段，隨著溫度的下降大豆蛋白分子活動(dòng)性下降，促進(jìn)了分子之間化學(xué)鍵的形成;慢的冷卻速率下大豆蛋白有充足的時(shí)間形成各種作用力從而增大了G'，而較快的冷卻速率則減少了各種作用力的形成從而降低了凝膠的強(qiáng)度，產(chǎn)生了不同的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)類型。與加熱速率對(duì)凝膠性質(zhì)的影響相比，冷卻速率對(duì)大豆蛋白凝膠性質(zhì)的影響相對(duì)較大。

2.4 加熱和冷卻速率對(duì)冷卻階段凝膠形成G'值的影響

加熱和冷卻速率對(duì)大豆蛋白凝膠性質(zhì)同樣有顯著的影響，如圖2c，慢的加熱和冷卻速率比快的加熱和冷卻速率形成的凝膠更強(qiáng)。值得注意的是，在較慢加熱和冷卻速率(0.5、1℃/min)下，G'在冷卻階段初期較大，然后隨著溫度的降低緩慢增大;在較快加熱和冷卻速率(2、4℃/min)時(shí)，G'在冷卻初期急劇增大，然后逐漸放緩。這種情況是由于在快的加熱和冷卻速率時(shí)，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在冷卻階段繼續(xù)形成，而慢的加熱和冷卻速率時(shí)，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在加熱階段形成冷卻階段加強(qiáng)。

改變加熱和冷卻速率同樣影響大豆蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，見圖3c。G'隨著加熱和冷卻速率的增大逐漸減少，而tanδ則逐漸的增大。對(duì)于G'，其逐漸減少和加熱(冷卻)速率對(duì)蛋白凝膠性質(zhì)的影響相一致(見圖3a和圖3b)，進(jìn)一步證明了慢的加熱(冷卻)速率增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子之間的相互作用并產(chǎn)生了更強(qiáng)的凝膠。而對(duì)于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)類型(tanδ決定)，同樣受到加熱和冷卻速率的影響，快的加熱和冷卻速率形成的tanδ較大，說明凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中黏性組成較大，這與圖3a和圖3b的結(jié)果相一致。

2.5 加熱和冷卻速率對(duì)凝膠點(diǎn)的影響

加熱和冷卻速率對(duì)凝膠點(diǎn)的影響結(jié)果如表1所示。隨著加熱速率的增大凝膠點(diǎn)增大，和冷卻速率無關(guān)。這與O'Kane等［12］的結(jié)果相一致，他們發(fā)現(xiàn)在較慢的加熱速率下豌豆蛋白初始凝膠形成的溫度較低。Renkema等［11］發(fā)現(xiàn)大豆蛋白在較快的加熱速率時(shí)其變性溫度較高，這就導(dǎo)致較高的凝膠溫度。雞蛋清蛋白、豌豆球蛋白和牛血清蛋白中有同樣的現(xiàn)象［13－14］。因此，可以得出凝膠點(diǎn)和加熱速率有關(guān)。在較低的加熱速率下蛋白質(zhì)分子有更多的時(shí)間重組和排列，因此，他們?cè)谳^低溫度下開始交聯(lián);在較高加熱速率下，蛋白質(zhì)分子沒有足夠的時(shí)間去重組和排列，因此，開始交聯(lián)時(shí)溫度較高。

冷卻速率對(duì)凝膠點(diǎn)無影響，如表1結(jié)果所示。在相同加熱速率不同冷卻速率下，蛋白質(zhì)有相似的凝膠點(diǎn)。當(dāng)加熱和冷卻速率都改變時(shí)，凝膠點(diǎn)只受加熱速率影響。

表1 加熱和冷卻速率對(duì)凝膠點(diǎn)的影響(SPI 12%)/℃

2.6 不同濃度對(duì)大豆蛋白凝膠性質(zhì)的影響

蛋白質(zhì)濃度對(duì)SPI凝膠性質(zhì)的影響見表2(加熱和冷卻速率2℃/min)。G'值隨著蛋白質(zhì)濃度的增大(從10%～15%)而增大，因?yàn)闈舛鹊脑龃筇岣吡说鞍踪|(zhì)分子交聯(lián)的機(jī)會(huì)從而形成了更強(qiáng)的凝膠構(gòu)造。Tanδ隨著蛋白質(zhì)濃度的增大而減少，說明高的蛋白質(zhì)濃度形成了三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更好的凝膠。凝膠點(diǎn)隨著蛋白質(zhì)濃度的增大從95℃降低到72℃，在P＜0.05水平上呈顯著性差異，說明凝膠點(diǎn)和蛋白質(zhì)的濃度相關(guān);這與Sun等［15］的研究結(jié)果不同，他們發(fā)現(xiàn)鹽溶豌豆蛋白的凝膠點(diǎn)與濃度無關(guān)。這可以解釋為在相同的溫度下濃度高的蛋白質(zhì)有更多的機(jī)會(huì)交聯(lián)，所以高濃度的蛋白質(zhì)溶液在較低的溫度下就開始形成凝膠。

表2 不同濃度對(duì)大豆蛋白凝膠性質(zhì)的影響

3 結(jié)論

加熱和冷卻速率影響熱誘導(dǎo)大豆蛋白的凝膠性質(zhì)和結(jié)構(gòu)。在相同冷卻速率下(2℃/min)，隨著加熱速率的增大(從0.5～4℃/min)，凝膠點(diǎn)逐漸增大而凝膠強(qiáng)度逐漸減小;在相同加熱速率下(2℃/min)，隨著冷卻速率的增大(從0.5～4℃/min)，最終凝膠強(qiáng)度逐漸減小而凝膠點(diǎn)基本保持不變。慢的加熱(冷卻)速率形成更小的tanδ，表明形成更好的三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu);慢的加熱(冷卻)速率產(chǎn)生更大的G'值，表明形成更強(qiáng)的凝膠強(qiáng)度;而凝膠點(diǎn)隨著加熱速率的增大而增高，與冷卻速率無關(guān)。增大蛋白質(zhì)濃度可以提高凝膠強(qiáng)度，而tanδ值和凝膠點(diǎn)隨著蛋白質(zhì)濃度的增大而減少。因此，在食品生產(chǎn)中可行的途徑是調(diào)控加熱和冷卻速率以控制大豆蛋白的凝膠強(qiáng)度，生產(chǎn)出最適的凝膠特性，而不用改變蛋白質(zhì)的濃度。

［1］Van Kleef F S M.Thermally induced protein gelation:gelation and rheological characterization of highly concentrated ovalbumin and soybean protein gels［J］.Biopolymers，1986，25(1):31－59

［2］Ikeda S，Nishinari K.On solid － like rheological behaviors of globular protein solutions［J］.Food Hydrocolloids，2001，15(4):401－406

［3］Lakemond C M M，de Jongh H H J，Paques M，et al.Gelation of soy glycinin;influence of pH and ionic strength on network structure in relation to protein conformation［J］.Food Hydrocolloids，2003，17(3):365 －377

［4］郭興鳳，張艷紅，陸惠，等.大豆分離蛋白凝膠制備和凝膠質(zhì)構(gòu)特性研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2005，20(6):68 －70

［5］華欲飛，Cui Steve W，Wang Qi，等.不同大豆分離蛋白凝膠的流變性性質(zhì)［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2003，18(6):43－48

［6］Tunick M H.Small－ strain dynamic rheology of food protein networks［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，59(5):1481 －1486

［7］Sun X D，Arntfield S D.Dynamic oscillatory rheological measurement and thermal properties of pea protein extracted by salt method:effect of pH and NaCl［J］.Journal of Food Engineering，2011，105(3):577 －582

［8］Uruakpa F O，Arntfield S D.Impact of urea on the microstructure of commercial canola protein–carrageenan network:a research note［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2006，38(2):115 －119

［9］Sun X D，Arntfield S D.Gelation properties of salt－extracted pea protein isolate induced by heat treatment:effect of heating and cooling rate［J］.Food Chemistry，2011，124(3):1011 －1016

［10］Paulson A T，Tung M A.Thermally induced gelation of succinylated canola protein isolate ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1989，37(2):319 －326

［11］Renkema J M S，van Vliet T.Heat－ induced gel formation by soy proteins at neutral pH ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(6):1569 －1573

［12］O＇Kane F E，Happe R P，Vereijken J M，et al.Heat－ induced gelation of pea legumin:comparison with soybean glycinin［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52(16):5071－5078

［13］Donovan J W，Mapes C J，Davis J G，et al.A differential scanning calorimetric study of the stability of egg white to heat denaturation ［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1975，26(1):73 －83

［14］Arntfield S D，Murray E D.Heating rate affects thermal properties and network formation for vicilin and ovalbumin at various pH values［J］.Journal of Food Science，1992，57(3):640－646

［15］Sun X D，Arntfield S D.Gelation properties of salt－ extracted pea protein induced by heat treatment［J］.Food Research International，2010，43(2):509 －515.