一株辛基酚聚氧乙烯醚降解菌的篩選、鑒定及其降解

關(guān)向杰,賀強禮,黃水娥,狄 準(zhǔn),楊海君 (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院,湖南 長沙 410128)

辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)類非離子表面活性劑由于性能優(yōu)良已在工業(yè)相關(guān)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,隨著大型聚氧乙烯裝置的建成投產(chǎn)和國民經(jīng)濟的快速增長而成為第二大類非離子表面活性劑.由于辛基酚聚氧乙烯醚及其中間代謝產(chǎn)物具有難降解、疏水性、脂溶性和生物累積等特性,大量使用必然會產(chǎn)生環(huán)境污染問題[1-5].OPnEO污染的治理方法很多,如混凝沉降法、泡沫分離法、催化氧化法及活性污泥法等,但最佳的方法是生物降解法[6].關(guān)于OPnEO降解菌的研究已有很多報道[7-11],但大多數(shù)工作主要集中在降解菌的篩選、降解性能、降解途徑和影響因素等方面.除 2006年日本學(xué)者 Tasaki等[12]報道OPnEO降解基因 adh1外,一直沒有關(guān)于分子水平上 OPnEO降解機理的研究.本研究從受TX-100(OPnEO,n=9～10)長期污染的制革廢水中分離到一株可利用 TX-100作為唯一碳源的細(xì)菌,命名為H1,并利用生理生化和16S rDNA序列分析對其進行鑒定.采用 LC-MS和 UPLC-QTOF-MS對降解產(chǎn)物和降解途徑進行了分析和推測.此外還從分子水平上證實了菌株 H1中存在 TX-100降解性質(zhì)粒.研究結(jié)果為處理環(huán)境污染物及進一步從分子水平上克隆與OPnEO降解有關(guān)的基因和構(gòu)建高效降解多種污染物的基因工程菌奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 溶菌肉湯培養(yǎng)基(LB):酵母浸出物 5.0g/L,胰蛋白胨 10.0g/L,氯化鈉 10.0g/L,pH7.2.篩選培養(yǎng)基(g/L)[11]:NaCl (0.5), (NH4)2SO4(2.0), MgSO4(0.24), CaCl2(0.01), Na2HPO4(6.8),KH2PO4(3.0),TX-100(1.0),維生素溶液(2mL/L),微量元素溶液(1mL/L).降解培養(yǎng)基(TX-A)[13]培養(yǎng)基成分如下(g/L):NaCl (2.5), (NH4)2SO4(2.0),MgSO4·7H2O (0.3), CaCl2(0.01),Na2HPO4(3.7),KH2PO4(0.9),TX-100(1.0),維生素溶液(2.0mL/L),微量元素溶液(1.0mL/L).維生素溶液成分(mg/100mL):鹽酸吡多辛(10.0),核黃素(5.0),鹽酸硫胺素(5.0),硫辛酸(5.0),對氨基苯甲酸(5.0),葉酸(2.0),維生素H(2.0),維生素Bc(2.0),維生素B12(0.1),過濾滅菌.微量元素溶液的成分(mg/100mL):MnCl2·4H2O(20.0),CoCl2·6H2O(4.0),Na2MO4·2H2O(26.0),FeCl3·6H2O(15.0),配好后經(jīng)高壓滅菌121℃、20min,備用.

1.1.2 主要試劑 TX-100(純度＞99%)購于Sigma-aldrich公司,主要成分為OP9EO和OP10EO;十二烷基磺酸鈉(純度＞99%)購于深圳鵬程化學(xué)試劑有限公司,其余化學(xué)試劑均為分析純.

1.1.3 常用儀器 紫外可見分光光度儀(SHIMADZU,UVmin1240,Japan)、電泳儀(北京六一儀器廠,DYY-8C)、PCR擴增儀(ABI,verity,USA)、凝膠成像分析系統(tǒng)(Kodak,Gel Logic 212,USA),高效液相色譜儀(SHIMADZU,LC-20AT,Japan)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent, UPLC(1290)-Q-TOF(6530),ACQUITY-SQD,USA)等.

1.2 實驗方法

1.2.1 TX-100降解菌的富集、分離和純化 取皮革廠曝氣池廢水1mL加入到裝有100mL無菌水的三角瓶中,放入恒溫振蕩培養(yǎng)器中,30℃,200r/min振蕩培養(yǎng) 1h,再取 1mL加入到 100mL含1.0g/L TX-100的LB中,30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)16h,然后將此菌懸液1mL加入到100mL含1.0g/L TX-100的篩選培養(yǎng)基中,30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)24h,將此菌懸液制成10-1到10-7的稀釋液,然后分別取 100μL涂布于篩選培養(yǎng)基平板上,30℃倒置于培養(yǎng).用接種環(huán)挑取其中清晰可見的不同單菌落,在 LB平板上反復(fù)劃線分離,得到純菌株.

1.2.2 形態(tài)特征鑒定 觀察降解菌菌落的大小、表面形態(tài)、光澤度、粘稠度、潤濕情況、隆起和邊緣特征等,顯微鏡觀察菌株大小及形態(tài).

1.2.3 降解菌生理生化特性測定 采用廣州環(huán)凱微生物科技有限公司的非發(fā)酵細(xì)菌鑒定管(產(chǎn)品編號:070150),按照說明書操作.另采用法國梅里埃公司 VITEK 2COMPACT 全自動微生物鑒定藥敏檢測系統(tǒng)儀對降解菌進行快速培養(yǎng)鑒定和藥敏實驗.采用 0.3g/L Cr3+和0.6g/L Cr6+的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)H1,檢測該菌對重金屬鉻的耐受性.

1.2.4 16S rDNA序列的鑒定 細(xì)菌基因組提取采用天根生化(北京)有限公司細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒.方法見說明書.采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的細(xì)菌16S rDNA通用引物(27F:5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′和 1492R: 5′AAGGAGGTGA TCCAGCCGCA3′),以基因組DNA為模板進行16S rDNA的PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序,并建立系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.2.5 降解實驗 在無菌條件下,用生理鹽水(NaCl 0.85%)將培養(yǎng)好的菌液離心洗滌 3次,再加入適量生理鹽水振蕩均勻制成OD600=1.0的菌懸液.按照2%的接種量向TX-A培養(yǎng)基中加入制備的菌懸液,然后置于30℃、160r/min振蕩培養(yǎng)14d后,高效液相法(HPLC)測定TX-100的含量,并計算降解率.TX-100降解率=(Cck-Ct)/Cck×100%, Cck為空白處理中TX-100的濃度,Ct為振蕩培養(yǎng)若干天后殘留的TX-100濃度.

1.2.6 TX-100降解率測定和降解產(chǎn)物分析高效液相法(HPLC)測定 TX-100的含量:稱取0.5g TX-100用色譜甲醇溶解并定容到 100mL,作為TX-100的標(biāo)準(zhǔn)儲備液.向系列10mL容量瓶中分別加入 0、0.02、0.10、0.20、0.40、0.60、1.00mL TX-100標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用色譜甲醇稀釋至刻度.經(jīng) 0.22μm 微濾膜過濾后.在 HPLC上進樣測定.樣品前處理:降解培養(yǎng)基中加入等體積的甲醇混勻,取1000μL加入甲醇定容到2mL容量瓶后12000r/min離心30min,過0.22 μm有機濾膜后進高效液相色譜測定TX-100的殘留量.HPLC條件:分離柱:ZORBAX Edipse XDB-C18;流動相:V(甲醇): V(水)=90:10;波長:226nm;紫外檢測器:流速:1.0mL/min;柱溫:26℃.

采用液質(zhì)聯(lián)用(ULPC-MS和UPLC-Q-TOF)測定溶液中 TX-100及其中間產(chǎn)物:將 TX-100標(biāo)準(zhǔn)儲存液用色譜甲醇稀釋到 100μg/L.樣品加入等體積色譜甲醇混勻后取1mL用色譜甲醇稀釋到 100μg/L(ULPC-MS)和 10μg/L(UPLC-QTOF),離心過 0.2μm 有機濾膜后上機,進樣量為10μL.UPLC 條件:Agilent XDB-C18色譜柱;柱溫為35℃,流速為0.25mL/min;流動相A為0.1%甲酸溶液,流動相 B為乙腈,梯度洗脫程序為0～4min,10% B;4～4.1min,80% B;4.1～9min,10%B.UPLC-Q-TOF中UPLC色譜條件:流動相A為0.1%甲酸溶液,流動相B為乙腈,梯度洗脫程序為0～10min,10% B;10～10.1min,95% B;10.1～15min,10% B.質(zhì)譜條件:采用ES+離子模式,m/z范圍50～1000.Q-TOF條件:采用電噴霧電離離子源 ESI,正離子電離模式,m/z范圍100～1500.

1.2.7 乙醛和乙醛酸的檢測方法 乙醛的檢測采用亞硫酸氫鈉加成法[14],乙醛酸的檢測采用高錳酸鉀滴定法[15].

1.2.8 質(zhì)粒的檢測 采用全式金生物技術(shù)有限公司的質(zhì)粒小提試劑盒.

1.2.9 質(zhì)粒的消除 采用系統(tǒng)濃度 SDS法[16]和變溫SDS法[17].采用影印法[18]對能在LB平板上生長,而不能在 TX-A培養(yǎng)基上生長的質(zhì)粒消除后衍生菌進行質(zhì)粒檢測和藥敏檢測.

2 實驗結(jié)果

2.1 TX-100的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以 TX-100(OPnEO, n=9～10)濃度做橫坐標(biāo),HPLC測定的峰面積為縱坐標(biāo)得到如圖 1的標(biāo)準(zhǔn)曲線,R2=0.9997.

2.2 降解菌的分離純化

經(jīng)過富集、分離和純化,獲得一株能在含1.0g/L高濃度TX-100的無機鹽培養(yǎng)基平板上迅速生長的細(xì)菌.同時,對該菌進行降解實驗,經(jīng)30℃、160r/min培養(yǎng)14d后,TX-100降解率到達81.69%,說明具有降解TX-100的能力,命名為H1.并對該菌進行馴化,采用含TX-100濃度為 1.0,1.5,2.0,2.5,3.0g/L篩選培養(yǎng)基,從低濃度到高濃度逐步馴化后使其可在更高濃度條件下生長.采用甘油保藏法保存菌株 H1于-80℃冰箱.

圖 1 TX-100標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calibration curve of TX-100solution

2.3 降解菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征鑒定 菌株H1的菌落呈圓形、中間隆起、邊緣整齊、濕潤有光澤、較粘稠.菌株細(xì)胞呈短桿狀,有鏈狀排列,革蘭氏染色陰性,有莢膜,無鞭毛和芽孢,其菌落形態(tài)、顯微鏡照片見圖2～圖5.

圖2 H1的菌落照片F(xiàn)ig.2 Colonies photos of H1

圖3 H1的莢膜形態(tài)Fig.3 The bacterial capsule picture of H1

圖4 H1的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.4 SEM image of H1

圖5 H1的透射電鏡照片F(xiàn)ig.5 SEM image of H1

2.3.2 生理生化鑒定 采用廣州環(huán)凱微生物科技有限公司的非發(fā)酵細(xì)菌鑒定管(產(chǎn)品編號:070150),結(jié)果見表1.

表1 H1的生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Results of physiological and biochemical tests of H1

查看非發(fā)酵細(xì)菌生化鑒定編碼冊,鑒定 H1生理生化特性與醋酸鈣不動桿菌相似性較高,機率為 0.5344,說明該菌株很典型.另外,采用法國梅里埃公司VITEK 2COMPACT全自動微生物鑒定藥敏檢測系統(tǒng)儀對降解菌H1進行快速培養(yǎng)鑒定及藥敏實驗,鑒定 H1藥敏性與魯氏不動桿菌相近,其藥敏結(jié)果見表 2.菌株 H1對多種抗生素具有耐受性,這與報道的不動桿菌多具有耐藥性[19-21]是一致的.2種鑒定結(jié)果的差異,可能由于本實驗用的全自動微生物鑒定系統(tǒng)的菌種數(shù)據(jù)庫不全,該數(shù)據(jù)庫主要針對醫(yī)學(xué)病原菌.另外,該菌對重金屬鉻有一定耐受性,在 0.3g/L Cr3+和0.6g/L Cr6+的LB培養(yǎng)基中能正常生長.

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 菌株H1總DNA的提取按照天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作,得到菌株 H1的總 DNA.以菌株 H1的總DNA為模板,利用細(xì)菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增到片段大小為1500bp左右,經(jīng)測序得到長為 1451bp的 16S rDNA序列.將已測序列在NCBI上Blast分析,結(jié)果顯示H1與Acinetobactersp.具有很高的同源性(大于 97%),并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖 6.根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定和16S rDNA同源比對結(jié)果,可初步鑒定菌株H1屬于醋酸鈣不動桿菌屬.

表2 H1的藥敏結(jié)果Table 2 Results of tests of H1

2.4 降解產(chǎn)物分析

HPLC-MS測定對照和發(fā)酵14d后TX-A培養(yǎng)基中 TX-100及其中間產(chǎn)物的濃度,結(jié)果見圖7～圖 8.從圖 7、圖 8中 UPLC圖譜可以看出,對照在 4.64min和 4.93min有明顯的峰形出現(xiàn),而TX-A只有在4.64min有;從對照的MS圖中可以看出,在4.64min和4.93min的峰中, OPnEO分子離子主要分布為m/z427.2693+ 44nEO(nEO=5～13),它們對應(yīng)[M+H]+,相鄰離子之間間隔一個乙氧基(C2H4O),質(zhì)量數(shù)相差44,而從TX-A的MS圖中未檢測到 OPnEO(n=5～13),說明在 TX-A 中OPnEO已降解,但分析結(jié)果未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的中間降解產(chǎn)物,仍需要進一步檢測分析.

采用超高效相液相色譜聯(lián)合飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜分析降解產(chǎn)物,并分析降解機理.UPLC-QTOF-MS檢測發(fā)酵 7d后的 TX-A培養(yǎng)基有OPnEO(n=1～18)存在,14d后的 TX-A 中只有OPnEO(n=10～18)存在,說明環(huán)氧乙烷的聚合度越大,越難降解.在7d的TX-A中檢測到OP4EC(圖9),說明有末端氧化現(xiàn)象發(fā)生,推測降解先從羥基端 EO氧化開始.這與 Shibata等[31]的發(fā)現(xiàn)一致,在好氧條件下Ca2+可使Pseudomonas putidaS-5加速形成辛基酚聚氧乙烯醚乙酸(OPnEC),而不生成辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO).

圖6 根據(jù)遺傳距離建立H1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic and molecular evolutionary analyses of H1

圖7 對照培養(yǎng)基中的UPLC和MS圖譜Fig.7 UPLC and MS profile of the contrast medium

在培養(yǎng)7d的TX-A培養(yǎng)基中檢測到乙醛酸的存在,這可能由降解過程中乙醚鏈的斷裂而產(chǎn)生的.結(jié)合TX-100降解產(chǎn)物的檢測和分析結(jié)果,可以初步推測TX-100的降解先從EO末端逐步氧化,醚鍵斷裂,釋放出乙醚酸,最終形成新的化合物.

2.5 H1質(zhì)粒提取

采用較溫和的堿裂解法質(zhì)粒小提試劑盒對H1進行質(zhì)粒提取,得到較明顯的多條質(zhì)粒條帶,如圖10所示.

圖8 培養(yǎng)14d后TX-A的UPLC和MS圖譜Fig.8 UPLC and MS profile of TX-A after training 14 days

圖9 OP4EC的MS圖譜Fig.9 MS zoomed spectrum profile of OP4EC

從圖10可以看出,在3～15kb之間有明顯的4條帶,這說明H1的質(zhì)粒可能有2種或2種以上.這與大多數(shù)研究[17,22]不動桿菌的質(zhì)粒及其耐藥性研究的結(jié)果一致,大多數(shù)不動桿菌都含有質(zhì)粒,且有些含有2個或2個以上.此外,研究還發(fā)現(xiàn)不動桿菌的耐藥性與質(zhì)粒有關(guān),部分質(zhì)粒消除后的不動桿菌會喪失對一些抗生素的抗性,且能夠通過接合方式在細(xì)菌之間發(fā)生轉(zhuǎn)移[23].這對不動桿菌質(zhì)粒與降解能力的研究有一定的指導(dǎo)作用.

圖10 質(zhì)粒提取與檢測Fig.10 Plasmid extraction and detection

2.6 質(zhì)粒消除結(jié)果

通過影印得到質(zhì)粒消除后的菌株,結(jié)果如圖11所示.

圖 11 LB(左)與 TX-A(右)影印對照Fig.11 Comparative result between LB flat (left) and TX-A flat (right)

H1經(jīng)過質(zhì)粒消除處理丟失了質(zhì)粒,隨機將質(zhì)粒消除后的H1命名為H1T1、H1T2、H1T3、H1T4和 H1T5.H1T1、H1T2、H1T3、H1T4和H1T5質(zhì)粒電泳檢測結(jié)果見圖12.

由圖 12可見.H1T1、HIT2、H1T3、H1T4和H1T5已檢測不到質(zhì)粒.而H1的DNA條帶與圖10中H1的DNA條帶大小一致.通過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒消除后的衍生菌株與原始菌株相比,其耐受和降解TX-100能力明顯降低,說明TX-100的降解可能和質(zhì)粒有關(guān).

圖12 質(zhì)粒消除后檢測結(jié)果Fig.12 Detection of plasmid after annihilation

采用法國梅里埃公司 VITEK 2COMPACT全自動微生物鑒定藥敏檢測系統(tǒng)儀對 H1T5進行快速培養(yǎng)鑒定及藥敏實驗,從其藥敏結(jié)果可以得出質(zhì)粒消除前后,H1和H1T5對呋喃妥因、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、亞胺培南和左旋氧氟沙星的藥敏度未變,其中對呋喃妥因和頭孢唑啉為耐藥,其它為敏感;對氨芐西林、阿米卡星和復(fù)方新諾明的藥敏度由耐藥變?yōu)槊舾?推測質(zhì)粒上可能攜帶這些抗生素的抗性基因;對頭孢匹肟、氨芐西林/舒巴坦和氨曲南的藥敏度有變化,但不是很明顯.

3 結(jié)論

3.1 從皮革廠污水曝氣池中篩選到一株能夠耐受較高濃度TX-100且降解性能較好的菌株H1,經(jīng) 30℃、160r/min培養(yǎng) 14d后,H1對 1.0g/L TX-100的降解率可達 81.69%.對該細(xì)菌進行了形態(tài)學(xué)特征、生理生化反應(yīng)鑒定和16S rDNA序列分析,初步鑒定 H1為醋酸鈣不動桿菌屬(Acinetobacter calcoaceticus).并發(fā)現(xiàn) H1對三價鉻、六價鉻和一些抗生素具有一定的耐受性.

3.2 對降解菌H1降解TX-100的降解產(chǎn)物分析,得出降解過程中產(chǎn)生了 C2H2O3和 OP4EC,可以初步推斷TX-100的降解先從EO末端氧化,醚鍵斷裂,釋放出乙醛酸,逐步縮短聚氧乙醚鏈,最終形成未知化合物.降解菌H1在只有TX-100為唯一碳源的環(huán)境下,降解 TX-100過程中不產(chǎn)生環(huán)境雌激素效應(yīng)最強的辛基酚.

3.3 對降解菌 H1進行降解性質(zhì)粒檢測和質(zhì)粒消除試驗,表明H1對TX-100的降解與其質(zhì)粒有關(guān),說明該質(zhì)粒為降解性質(zhì)粒.另外,質(zhì)粒消除后的衍生株對氨芐西林、阿米卡星和復(fù)方新諾明的藥敏度由耐藥變?yōu)槊舾?推測質(zhì)粒上可能攜帶這些抗生素的抗性基因.

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