HPLC法同時(shí)測(cè)定人血漿中拉米夫定、齊多夫定和奈韋拉平的濃度Δ

鄒尚榮，李燕青，周波，簡(jiǎn)鳳璧，陳諧捷（.廣州市第八人民醫(yī)院藥劑科，廣州 50060；.廣州市第八人民醫(yī)院感染科，廣州 50060）

高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（Highly active anti-retroviral therapy，HAART）是目前抗人類(lèi)免疫缺陷?。℉IV）治療的最有效和最主要的措施。初治HIV感染/艾滋?。ˋIDS）患者治療推薦方案為2種核苷類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NRTIs）+1種非核苷類(lèi)轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NNRTIs）或2種NRTIs+1種加強(qiáng)型蛋白酶抑制劑（PIs）（含利托那韋）[1]。拉米夫定（Lamivudine，3TC）、齊多夫定（Zidovudine，AZT）、奈韋拉平（Nevirapine，NVP）三者合用是我國(guó)目前抗HIV治療常用的三聯(lián)用藥方案之一，前兩者屬于NRTIs，而后者屬于NNRTIs。為便于臨床進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)和開(kāi)展藥動(dòng)學(xué)研究，本試驗(yàn)以甲硝唑（Metronidazole）為內(nèi)標(biāo)，建立了同時(shí)測(cè)定人血漿中3TC、AZT和NVP濃度的高效液相色譜（HPLC）法。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀，包括G1314B型紫外檢測(cè)器、Agilent色譜化學(xué)工作站（美國(guó)Agilent公司）；XW-B型渦旋混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；AL204型電子天平（瑞士Mether Toledo公司）；5417R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；B320A型離心機(jī)（北京白洋醫(yī)用離心機(jī)有限責(zé)任公司）；DZF-6021型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

3TC對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào):101007-200701，純度＞99.7%）；AZT對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào):100672-200401，純度＞99.5%）；NVP對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào):100641-200401，純度＞99.5%）；內(nèi)標(biāo):甲硝唑（安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào):1209205D）；乙腈、乙酸乙酯為色譜純，水為雙重蒸餾去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18（150mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相:乙腈-水（梯度洗脫程序:0～10min為5∶95，10.1～18.8min為25∶75）；流速:0.8ml/min；柱溫:30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng):268nm；進(jìn)樣量:30 μl。

2.2 對(duì)照品貯備液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取3TC、AZT、NVP對(duì)照品各適量，分別置于10ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制得質(zhì)量濃度為1mg/ml的對(duì)照品貯備液，貯存于4℃冰箱內(nèi)避光保存?zhèn)溆?。試?yàn)前按需用乙腈-水（10:90）混合液稀釋至相應(yīng)濃度并混合成3TC-AZT-NVP標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 內(nèi)標(biāo)貯備液、內(nèi)標(biāo)溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取甲硝唑適量置于10ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1mg/ml的內(nèi)標(biāo)貯備液，貯存于4℃冰箱內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)前用乙腈-水（10∶90）混合液稀釋成濃度為30μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取含藥血漿0.25ml，置2.0ml離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液（30μg/ml甲硝唑溶液）50μl，渦旋振蕩3 s，再加入乙腈0.75ml，密塞，渦旋振蕩1min，以離心半徑為8 cm、轉(zhuǎn)速為14000 r/min離心10min。吸取上清液置5.0ml的離心管內(nèi)，加入乙酸乙酯3.0ml，密塞，渦旋振蕩1min，以離心半徑為8 cm、轉(zhuǎn)速為5000 r/min離心10min。吸取上清液置5.0ml的離心管內(nèi)，真空干燥（42℃）至干。進(jìn)樣前加入乙腈-水（10∶90）200μl，渦旋振蕩10 s溶解殘?jiān)?，以離心半徑為8 cm、轉(zhuǎn)速為5000 r/min離心10min，吸取30μl上清液進(jìn)樣分析。

2.5 專(zhuān)屬性考察

取空白血漿0.25ml置2.0ml錐形離心管中，除不加內(nèi)標(biāo)外，按“2.4”項(xiàng)方法操作，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，獲得空白血漿樣品的色譜圖，見(jiàn)圖1A；將一定濃度的3TC-AZT-NVP混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿中，同法操作獲得色譜圖1B，3TC、AZT、NVP和甲硝唑分別在6.1、14.4、17.7、11.2min出峰；取HIV感染者同時(shí)口服3TC片（艾息?，安徽貝克生物制藥有限公司）、AZT片（克度?，東北制藥總廠）及NVP片（艾太?，浙江華海藥業(yè)股份有限公司）后收集的血漿樣品，同法操作，得色譜圖1C。由圖1可見(jiàn)，3TC、AZT、NVP及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定不受血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，本方法具有較高的專(zhuān)屬性。

圖1 典型色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+3TC（1 μg/ml）+AZT（1 μg/ml）+NVP（2 μg/ml）+甲硝唑（6μg/ml）；C.受試者口服3TC片（300mg）、AZT片（600mg）和NVP片（400mg）后收集的血漿樣品；1.3TC ；2.甲硝唑；3.AZT；4.NVPFig 1 Typical chromatogramA.blank plasma；B.blank plasma+3TC（1 μg/ml）+AZT（1 μg/ml）+NVP（2 μg/ml）+metronidazole（6 μg/ml）；C.plasma after taking 3TC tablet（300mg），AZT tablets（600mg）and NVP tablets（400mg）orally；1.3TC；2.metronidazole；3.AZT；4.NVP

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限考察

取空白血漿0.25ml，分別加入同時(shí)含有質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、2.5、5、25、40、50 μg/ml 3TC，0、0.25、0.5、2.5、5、25、40、50 μg/ml AZT以及0、0.5、1、5、10、50、80、100 μg/ml NVP的3TC-AZT-NVP混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50μl，振蕩3 s，使3TC血藥濃度相當(dāng)于 0、0.05、0.1、0.5、1、5、8、10 μg/ml，AZT血藥濃度相當(dāng)于 0、0.05、0.1、0.5、1、5、8、10 μg/ml，NVP血藥濃度相當(dāng)于0、0.1、0.2、1、2、10、16、20 μg/ml。其余項(xiàng)按“2.4”項(xiàng)方法處理，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。以藥物峰面積與內(nèi)標(biāo)甲硝唑峰面積之比（y）對(duì)藥物血漿濃度與內(nèi)標(biāo)甲硝唑濃度之比（x）進(jìn)行線性回歸，分別得3TC、AZT、NVP回歸方程為:y＝2.095x+0.0187（r＝0.9981，n＝7）；y＝2.7668x+0.0218（r＝0.9990，n＝7）；y＝2.1348x+0.0162（r＝0.9983，n＝7）。結(jié)果表明，三者血藥濃度分別在0.05～10、0.05～10、0.1～20μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；定量限分別為0.05、0.05、0.1 μg/ml。

2.7 精密度及方法回收率試驗(yàn)

按“2.6”項(xiàng)方法分別配制低（3TC 0.1 μg/ml、AZT 0.1 μg/ml、NVP 0.2 μg/ml）、中（3TC 1 μg/ml、AZT 1 μg/ml、NVP 2 μg/ml）和高（3TC 8 μg/ml、AZT 8 μg/ml、NVP 16 μg/ml）質(zhì)量濃度的3TC-AZT-NVP血漿質(zhì)控樣品各15份，分為3批，每批5份，每批隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，依“2.4”項(xiàng)方法處理后，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算質(zhì)控樣品的濃度。將測(cè)得量與配制量對(duì)照，考察本法的準(zhǔn)確度（方法回收率）和精密度，結(jié)果分別見(jiàn)表1、表2及表3。結(jié)果表明，本法測(cè)定血漿中3TC、AZT與NVP濃度的準(zhǔn)確性與精密度高、重現(xiàn)性好。

2.8 提取回收率試驗(yàn)

分別配制低（3TC 0.1 μg/ml、AZT 0.1 μg/ml、NVP 0.2 μg/ml）、中（3TC 1 μg/ml、AZT 1 μg/ml、NVP 2 μg/ml）和高（3TC 8μg/ml、AZT 8 μg/ml、NVP 16 μg/ml）質(zhì)量的 3TC-AZT-NVP血漿質(zhì)控樣品，處理后測(cè)定，以所得峰面積與相應(yīng)濃度對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣所得峰面積比較，計(jì)算提取回收率，結(jié)果分別見(jiàn)表1、表2及表3。結(jié)果表明，3TC、AZT與NVP低、中、高3個(gè)濃度的提取回收率對(duì)測(cè)定結(jié)果影響程度基本一致。

表1 3TC回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of recovery and precision tests of 3TC

表2 AZT回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of recovery and precision tests ofAZT

表3 NVP回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of recovery and precision tests of NVP

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.6”項(xiàng)方法分別配制低（3TC 0.1 μg/ml、AZT 0.1 μg/ml、NVP 0.2 μg/ml）、中（3TC 1 μg/ml、AZT 1 μg/ml、NVP 2 μg/ml）和高（3TC 8 μg/ml、AZT 8 μg/ml、NVP 16 μg/ml）質(zhì)量的3TC-AZT-NVP血漿質(zhì)控樣品，分別考察經(jīng)室溫避光放置1 h和24h、凍融1次和3次、－20℃凍存3 d和7 d的穩(wěn)定性。結(jié)果3種血藥濃度3TC、AZT和NVP在上述條件下的RSD值均＜15%，符合方法學(xué)要求。

2.10 臨床樣本檢測(cè)

從我院HIV門(mén)診抽取9例HIV/AIDS患者的血漿，這些患者均服用3TC-AZT-NVP治療方案且達(dá)半年以上。血漿樣本按“2.4”項(xiàng)方法處理后，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 HIV/AIDS患者血漿3TC-AZT-NVP濃度測(cè)定結(jié)果Tab 4 Determination results of 3TC-AZT-NVP blood concentration of HIV/AIDS patients

3 討論

HAART是全球公認(rèn)為現(xiàn)今抗病毒治療HIV感染/AIDS最主要的有效措施，但所用藥物在有效抑制病毒復(fù)制的同時(shí)，毒副反應(yīng)較大、耐藥及個(gè)體差異等問(wèn)題突出。通過(guò)治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM）指導(dǎo)臨床個(gè)體化合理用藥，提高抗病毒治療效果和患者的依從性，盡可能避免過(guò)高藥量導(dǎo)致的毒副作用和偏低藥量誘發(fā)耐藥等情況則顯得尤為重要。

同時(shí)檢測(cè)血漿中3TC、AZT、NVP濃度的方法，有HPLC-紫外（UV）法[2]和液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）法[3-4]。LC-MS/MS法靈敏度高，但設(shè)備較昂貴，難將其常規(guī)應(yīng)用于二、三級(jí)醫(yī)院的TDM。HPLC法穩(wěn)定性好、成本較低，可滿足抗HIV藥物臨床監(jiān)測(cè)的需要，故本研究意在探尋HPLC-UV法同時(shí)測(cè)定3種常用抗HIV藥物濃度的優(yōu)選方法，并用于TDM。

根據(jù)文獻(xiàn)[5]，3TC、AZT、NVP的最大吸收波長(zhǎng)分別為275、268、282nm。最大吸收波長(zhǎng)處的響應(yīng)值（AU）從大到小分別為NVP、3TC和AZT。綜上，比較三者在268、273、278nm波長(zhǎng)處的響應(yīng)值:3TC在268nm與273nm波長(zhǎng)處AU相近且大于其在278nm處AU；AZT在268nm波長(zhǎng)處AU為三波長(zhǎng)中最高；NVP雖在268nm波長(zhǎng)處AU為中值，但亦為此處3TC及AZT AU的6～7倍。為使三者均有較好響應(yīng)，故確定268nm為本研究方法的檢測(cè)波長(zhǎng)。

將法莫替丁、司他夫定、甲硝唑、替硝唑、奧硝唑等作內(nèi)標(biāo)考察，發(fā)現(xiàn)司他夫定、甲硝唑、替硝唑、奧硝唑在本方法的色譜條件下有較強(qiáng)吸收，但唯有甲硝唑的出峰時(shí)間最合適，且介于3TC和AZT之間、分離度好、內(nèi)源性物質(zhì)不干擾，故確定甲硝唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)。

3TC極性強(qiáng)，NVP極性弱，AZT極性介于兩者之間。單用乙腈、乙酸乙酯或叔丁基甲醚提取，難達(dá)到理想提取效果。用乙腈-乙酸乙酯混合體系（2∶1、1∶1、1∶2）作提取溶劑，3種目標(biāo)藥物及內(nèi)標(biāo)皆能被提取。但僅采用一步液-液萃取后雜質(zhì)始終較多，且雜質(zhì)會(huì)隨乙腈比例的增加而增加。故采取先用乙腈沉淀后再對(duì)上清液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取的方法，結(jié)果顯示雜質(zhì)明顯減少，提取效果較好。

AIDS患者常因HAART和機(jī)會(huì)性感染治療而需同時(shí)服用較多藥物。本方法對(duì)9例門(mén)診臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，3種目標(biāo)藥物及內(nèi)標(biāo)皆無(wú)干擾（見(jiàn)圖1C），證明本法可應(yīng)用于AIDS患者TDM。由表4可知，患者的3TC-AZT-NVP血藥濃度存在較明顯個(gè)體差異，有必要對(duì)HAART進(jìn)行TDM以確保療效穩(wěn)定。

本方法僅需用0.25ml血漿，低于文獻(xiàn)報(bào)道的0.50ml[2]，無(wú)需固相萃取[3]，對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求不高[3-4]，操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，是臨床常規(guī)開(kāi)展3TC、AZT和NVP血藥濃度同時(shí)監(jiān)測(cè)及藥動(dòng)學(xué)研究的優(yōu)選方法。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)艾滋病學(xué)組.中華醫(yī)學(xué)會(huì)第五次全國(guó)艾滋病、病毒性丙型肝炎暨全國(guó)熱帶病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C].2011:44.

[2]Nandi U，Das A，Roy B，et al.Development and validation of an HPLC-UV method for simultaneous determination of zidovudine，lamivudine，and nevirapine in human plasma and its application to pharmacokinetic study in human volunteers[J].Drug Test Anal，2013，5（6）:485.

[3]Kumar VR，Reddy BR，Sreekanth K，et al.High throughput LC-MS/MS method for simultaneous determination of zidovudine，lamivudine and nevirapine in human plasma[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013（921/922）:9.

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[5]Herve R，Bernard M，Corinne C，et al.Determination of 19 antiretroviral agents in pharmaceuticals or suspected products with two methods using high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr B，2007，850:376.