白芍總苷對糖尿病大鼠腎組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

武曉旭，章超群，許 坤，徐興欣，吳永貴

近年來研究［1－2］表明炎癥機制是糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)生、發(fā)展的主要機制之一，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 (endoplasmic reticulum stress，ERS)反應(yīng)可以引起一系列壓力信號的傳導(dǎo)，其中包括氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。在體外培養(yǎng)的實驗［3］中，有學(xué)者用不同濃度的晚期終末產(chǎn)物刺激鼠足細胞，發(fā)現(xiàn)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)的表達增加，同時誘導(dǎo)ERS。在用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立大鼠1型糖尿病模型的動物實驗［4］中，顯示模型組腎組織GRP78和CHOP/GADD153表達升高，表明ERS和DN相互聯(lián)系。白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)是從中國傳統(tǒng)中藥芍藥的干燥根中提取的混合物，具有抗炎和抑制自身免疫反應(yīng)的作用［5］。TGP在臨床上已用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者改善病情;在大量人及動物實驗［6－9］中，也表明其對系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、變應(yīng)性接觸性皮炎及佐劑性關(guān)節(jié)炎具有治療作用，且無明顯毒副作用。有研究［10］表明TGP對DN有明顯的保護作用，在此基礎(chǔ)上，該實驗從ERS通路觀察TGP對DN大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 50只Munich-Wistar大鼠(購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，昆明種，普通級，180～200 g。

1.1.2 主要試劑 STZ(美國Sigma公司);尿白蛋白測定試劑盒(法國SPI公司);兔抗大鼠GRP78多克隆抗體(美國Santa Cruz公司);兔抗大鼠磷酸化的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase，p-PERK)多克隆抗體及兔抗大鼠磷酸化的真核細胞翻譯起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，p-eIF2α)多克隆抗體(美國 Cell Signaling 公司);山羊血清、3%H2O2去離子水、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、二步法免疫組化檢測試劑盒PV-9000(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

1.1.3 干預(yù)藥物 TGP由安徽醫(yī)科大學(xué)魏偉教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)條件 實驗前所有大鼠均在室溫(22±2)℃、相對濕度(55±5)%、光照周期12～12 h的環(huán)境中適應(yīng)飼養(yǎng)1周。實驗期間保證所有大鼠飲水、標(biāo)準(zhǔn)飲食充足，定時更換敷料，不予胰島素治療，連續(xù)觀察8周。

1.2.2 糖尿病大鼠分組和模型制備 大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，被隨機分為對照組(n=10)、模型組(n=10)和 TGP給藥組(n=30)。STZ使用前用0.01 mmol/L的無菌檸檬酸緩沖液配制為6.5 g/L，pH 4.5，模型組和TGP給藥組大鼠腹腔單次注射STZ(65 mg/kg)，對照組注射等量檸檬酸緩沖液。2～3 d后用血糖儀經(jīng)尾靜脈采血測血糖，隨機血糖≥16.7 mmol/L者視為糖尿病大鼠，TGP給藥組再隨機分為3組(n=10)，TGP使用前溶于1%羧甲基纖維素鈉溶液中，每天按50、100、200 mg/kg灌胃給藥，對照組和模型組給予等量蒸餾水。

1.2.3 標(biāo)本收集 實驗8周末，用代謝籠收集所有大鼠24 h尿液，記尿量，置于－80℃冰箱保存待測尿白蛋白。稱量大鼠體重，腹腔注射戊巴比妥麻醉大鼠，行右頸總動脈插管取血，置于－20℃冰箱中待測血糖。再通過右頸總動脈插管注入生理鹽水反復(fù)灌洗腎臟，去除包膜后稱量腎重。

1.2.4 生化指標(biāo)的檢測 尿白蛋白含量使用酶聯(lián)免疫法測定，尿白蛋白含量與24 h尿量乘積即為UAER。血糖使用葡萄糖氧化酶法，用全自動生化分析儀測定。

1.2.5 免疫組化測定 GRP78、p-PERK 及 p-eIF2α的表達 腎組織用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成2 μm厚經(jīng)多聚賴氨酸處理的切片，采用PV兩步法，石蠟切片烤片后常規(guī)脫蠟至水，微波熱修復(fù)抗原，3%H2O2去離子水室溫孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗，甩干后滴加山羊血清37℃孵育封閉非特異性抗原，甩去山羊血清，分別滴加GRP78一抗(1∶1 000)，p-PERK一抗(1∶100)及p-eIF2α一抗(1∶100)，用PBS代替一抗作為陰性對照，4℃過夜，PBS沖洗，依次滴加聚合物輔助劑和辣根酶標(biāo)記山羊抗兔/小鼠IgG多聚體37℃孵育，應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片，鏡下觀察，陽性細胞呈棕黃色。

1.2.6 半定量分析 高倍鏡視野(×400倍)下每張切片隨機采集5個腎皮質(zhì)區(qū)，使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件處理圖像，用平均光密度(mean optical density，MOD)值判定結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，UAER為非正態(tài)分布資料，采用對數(shù)轉(zhuǎn)換后以幾何均數(shù)×/÷耐受因子表示。采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組一般情況及生化指標(biāo)的變化 實驗期間，模型組及TGP給藥組大鼠均出現(xiàn)體重減輕，多飲、多尿、多食。實驗8周末，TGP不能阻止大鼠血糖增高和體重減低。與對照組相比，模型組大鼠相對腎重(腎重/體重)明顯增加 (P＜0.05)，血糖、UAER顯著升高(P＜0.01)。與模型組相比，各TGP給藥組大鼠相對腎重有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;各TGP給藥組大鼠 UAER明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)，見表1。

表1 各組大鼠一般指標(biāo)變化(n=10，±s)

表1 各組大鼠一般指標(biāo)變化(n=10，±s)

與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;a表示為幾何均數(shù)×/÷耐受因子

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2.2 各組GRP78蛋白的表達 GRP78在對照組遠曲小管和集合管上皮細胞胞質(zhì)中呈弱表達，在模型組表達增強，主要在近曲小管胞質(zhì)中，部分腎小球細胞胞質(zhì)也呈強陽性表達。與對照組相比，模型組大鼠GRP78蛋白在腎小球和腎小管－間質(zhì)中表達明顯升高(P＜0.01)。與模型組相比，TGP各組大鼠GRP78在腎小球中表達低于模型組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;但在腎小管－間質(zhì)中表達明顯降低(P＜0.01)。見表2，圖1A1～E1。

表2 各組大鼠腎組織免疫組化指標(biāo)GRP78變化(n=10，±s)

表2 各組大鼠腎組織免疫組化指標(biāo)GRP78變化(n=10，±s)

與對照組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

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2.3 各組p-PERK蛋白的表達 p-PERK在對照組大鼠腎小管上皮細胞內(nèi)呈弱表達，腎小球內(nèi)無表達。與對照組相比，模型組大鼠p-PERK蛋白在腎小管上皮細胞胞質(zhì)中表達明顯增強(P＜0.01)。與模型組相比，TGP各組p-PERK蛋白在腎小管－間質(zhì)中表達明顯降低(P＜0.01)。見表3，見圖1A2～E2。

2.4 各組 p-eIF2α蛋白的表達 對照組 p-eIF2α蛋白少量表達于腎小球與腎小管－間質(zhì)。與對照組相比，模型組大鼠p-eIF2α蛋白在腎小球及腎小管－間質(zhì)中表達均顯著增加 (P＜0.01)。與模型組相比，TGP各組p-eIF2α蛋白在腎小球及腎小管－間質(zhì)中表達均明顯降低 (P＜0.01)。見表4、圖1A3～E3。

圖1 各組腎組織中GRP78、p-PERK、p-eIF2α的表達 PV二步法×4001:GRP78;2:p-PERK;3:p-eIF2α;A:對照組;B:模型組;C:TGP 50 mg/(kg·d)組;D:TGP 100 mg/(kg·d)組;E:TGP 200 mg/(kg·d)組

表3 各組大鼠腎組織免疫組化指標(biāo)p-PERK變化(n=10，±s)

表3 各組大鼠腎組織免疫組化指標(biāo)p-PERK變化(n=10，±s)

與對照組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

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表4 各組大鼠腎組織免疫組化指標(biāo)p-eIF2α變化(n=10，±s)

表4 各組大鼠腎組織免疫組化指標(biāo)p-eIF2α變化(n=10，±s)

與對照組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

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3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上有3種ERS元件與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78結(jié)合，這些蛋白分別是肌醇需求酶1，蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)和活化轉(zhuǎn)錄因子6。ERS發(fā)生時，為使細胞適應(yīng)應(yīng)激，GRP78離開上述3種跨膜蛋白，觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)［11］。PERK 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，當(dāng)未折疊蛋白及錯誤蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔內(nèi)積聚時，PERK發(fā)生自身二聚化和磷酸化，繼而使eIF2α發(fā)生磷酸化，從而衰減大部分蛋白翻譯，消除不成熟蛋白，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負荷［12］。

近年來越來越多的研究［13－14］顯示ERS與腎臟疾病聯(lián)系緊密。Lindenmeyer et al［15］以 DN 患者為研究對象，行腎穿刺或組織檢查，發(fā)現(xiàn)DN患者腎組織中UPR相關(guān)基因GRP78等的mRNA較對照組患者顯著增高，且ERS水平與DN的病變程度密切相關(guān)。另一研究中，研究者用STZ處理的9個月和22個月年齡的小鼠，經(jīng)過4個月的DM病程后，這些小鼠出現(xiàn)蛋白尿，肌酐升高，腎小球硬化，腎小管炎癥浸潤和纖維化，同時糖尿病組小鼠腎組織中GRP78、CHOP、p-PERK 和 p-eIF2α 表達增加，而在22個月的小鼠中表達更加明顯［16］。

對腎組織中ERS的抑制可能延緩DN的發(fā)展。4-苯基丁酸是一種分子伴侶，研究者用4－苯基丁酸處理糖尿病大鼠，結(jié)果顯示用藥組UAER較糖尿病組顯著降低，同時腎組織中GRP78和p-PERK的表達較糖尿病組明顯降低，炎癥因子及纖維化因子也顯著降低［17］。國內(nèi)也有動物模型實驗表明糖尿病大鼠腎小管中p-PERK和p-eIF2α較正常組增多，經(jīng)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑治療可明顯降低二者的表達［18］。均提示中斷ERS反應(yīng)在防治DN病程進展中具有重要的意義。

TGP為毛茛科植物芍藥的干燥根中提取的一組糖苷類物質(zhì)，對T、B淋巴細胞的增殖有雙向調(diào)節(jié)作用，具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)的作用，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及免疫性肝損害等疾病有明確療效。大量國內(nèi)研究［6－9］證實TGP對控制急慢性及免疫炎癥性疾病有明顯的作用，在對系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)大鼠的實驗研究中，發(fā)現(xiàn)TGP可以改善MsPGN大鼠腎小球系膜細胞增生和系膜基質(zhì)聚積，同時減輕蛋白尿和血肌酐、尿素氮，提示TGP可以部分逆轉(zhuǎn)受損的腎小球病理改變［19］。該課題組前期研究［20－22］顯示 TGP既可減少 ICAM-1、IL-1及TNF-α，也可抑制氧化應(yīng)激，從而推測TGP對糖尿病大鼠腎臟的保護反應(yīng)與其抑制炎癥免疫反應(yīng)及氧化應(yīng)激有關(guān)。本實驗中，TGP給藥可以顯著降低模型組大鼠UAER，明顯減少腎組織中ERS相關(guān)蛋白 GRP78、p-PERK和 p-eIF2α的表達，提示TGP有保護DN大鼠腎臟的作用，并且可能與抑制DN大鼠腎組織中的UPR反應(yīng)，抑制PERK-eIF2α通路有關(guān)。提示TGP對DN腎臟的保護作用可能與抑制ERS反應(yīng)有關(guān)，但因ERS與炎癥反應(yīng)通過一系列信號傳導(dǎo)通路包括產(chǎn)生活性氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放、核因子κB和有絲分裂原激活蛋白激酶等相互關(guān)聯(lián)［2］，其具體機制尚不明確，可在今后的研究中得以闡述。

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