淫羊藿苷與金雀異黃酮骨保護(hù)作用的比較研究

成 魁，陳克明，葛寶豐，甄 平，馬慧萍，高玉海

（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，甘肅蘭州 730050）

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性的代謝性骨病，以骨礦含量降低、骨組織微結(jié)構(gòu)退化、破壞和骨骼脆性增加為特點［1］。骨質(zhì)疏松癥由峰值骨量和骨丟失兩方面決定［2］。因此，既能提高峰值骨量，又能預(yù)防骨丟失的藥物為抗骨質(zhì)疏松之良藥。金雀異黃酮是一種大豆異黃酮，與雌二醇的結(jié)構(gòu)相似，是熱門的潛在抗骨質(zhì)疏松藥物。淫羊藿苷是一種在淫羊藿中分離出的黃酮苷類化合物，被報道能通過刺激成骨細(xì)胞分化和抑制破骨細(xì)胞骨吸收預(yù)防骨量丟失［3］。在本課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷比金雀異黃酮有更強(qiáng)的促進(jìn)成骨分化和礦化的能力，淫羊藿苷比金雀異黃酮在8位碳上多一個異戊烯基［4］。因此，假想淫羊藿苷的抗骨質(zhì)疏松能力比金雀異黃酮更強(qiáng)。為了研究此假說，本研究給予相同物質(zhì)的量的金雀異黃酮和淫羊藿苷作用于幼齡大鼠和切除卵巢大鼠，比較其藥效。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器 淫羊藿苷（純度≥98%，陜西寶雞辰光生物科技有限公司）；金雀異黃酮（純度≥98%，陜西寶雞辰光生物科技有限公司）；炔雌醇（純度≥98%，美侖生物公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶 5b（TRACP5B）ELISA試劑盒（IDS公司，英國）；骨鈣素（OC）ELISA試劑盒（IDS公司，英國），骨鈣素ELISA試劑盒（延吉公司，中國）；Technovit@9100試劑盒（Heraeus Kulzer GmbH＆Co.KG公司，德國）。雙能X射線骨密度儀（GE公司，美國）；AGIS萬能材料試驗機(jī)（島津公司，日本）；鋸式切片機(jī)（Leica公司，德國）；倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）；酶標(biāo)儀（BIP Tek公司，美國）。

1.2 實驗大鼠造模、分組與給藥 1月齡SD♀大鼠36只，SPF級，體質(zhì)量（125±3）g；6月齡 SD♀大鼠60只，SPF級，體質(zhì)量（235±5）g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供［合格證號：SCXK（甘）2004-0006-152］。

1月齡SD♀大鼠隨機(jī)分為3組（n＝12）：淫羊藿苷組（ICA，ig，25 mg·kg-1·d-1）、金雀異黃酮組（GEN，ig，10 mg·kg-1·d-1）、對照組（CON）。

6月齡SD♀大鼠隨機(jī)分為5組（n＝12）：假手術(shù)組（SHAM）、對照組（OVX）、淫羊藿苷組（ICA，ig，25 mg·kg-1·d-1）、金雀異黃酮組（GEN，ig，10 mg·kg-1·d-1）和炔雌醇組（E，ig，30μg·kg-1·d-1）。5組大鼠腹腔注射（ip）10%水合氯醛，劑量為3 ml·kg-1。假手術(shù)組大鼠行假手術(shù)切除卵巢周圍少許脂肪組織，OVX組、ICA組、GEN組和E組大鼠均切除雙側(cè)卵巢。大鼠飼養(yǎng)于SPF級實驗室，自由攝水和進(jìn)食，記錄每日進(jìn)食量和進(jìn)水量，每周稱1次體重。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 骨密度的測定 實驗開始后，每月在麻醉狀態(tài)下測一次全身骨密度，第3個月測完后即處死所有動物，剝離出右側(cè)股骨用于檢測骨密度。

1.3.2 血清生化指標(biāo)的測定 采用心臟取血法抽取血樣，4 000 r·min-1，離心10 min，取上層血清，-80℃保存；按試劑盒說明書制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，OC于450nm、TRACP 5b于405nm處測定OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出含量。

1.3.3 骨形態(tài)計量分析 將右側(cè)脛骨固定于80%乙醇中。嚴(yán)格按照Technovit@9100試劑盒操作說明書依次進(jìn)行脫水、脫塑、浸漬、滲透和包埋，聚合2 d后切片、磨片，用VG法染色，觀察骨骺線下1 mm至4 mm距離區(qū)域。

1.4 生物力學(xué)分析 將左側(cè)股骨用浸透生理鹽水的紗布包裹后，保存于-20℃。在實驗前24 h取出，于室溫下自然解凍。三點彎曲試驗的跨距為17 mm，速度為10 mm·min-1。記錄載荷變形曲線，得到包括最大載荷、屈服強(qiáng)度和彈性模量等指標(biāo)；試驗速度為10 mm·min-1。記錄載荷變形曲線，得到包括最大載荷、屈服強(qiáng)度和彈性模量等指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計分析均采用SPSS 16.0（SPSS公司，美國）軟件完成，組間比較采用方差分析和LSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1 體重檢測結(jié)果 1月齡大鼠體重在實驗后第3個月時，組間無差異。6月齡大鼠體重在實驗后第3個月時，與OVX組相比，E組差異有顯著性，見Tab 1。

Tab 1 Result of body weight of rats（±s，n＝12）

Tab 1 Result of body weight of rats（±s，n＝12）

6-mo-old rat，*P＜0.05 vs OVX

Group Body weight/g 1-mo-old CON 239.57±21.62 ICA 241.18±17.06 GEN 238.34±19.83 6-mo-old SHAM 242.65±20.33 OVX 259.11±24.17 ICA 274.45±45.11 GEN 279.97±16.28 E 214.16±23.19*

2.2 骨密度檢測結(jié)果 1月齡大鼠口服淫羊藿苷3個月后，相比較CON組，其全身骨密度明顯提高，而GEN組無明顯變化（Fig 1）。同時，ICA組平均值高于GEN組（P＜0.05）。6月齡大鼠切除卵巢3個月后，與SHAM組比較，全身骨密度明顯降低，表明骨質(zhì)疏松模型建立。與OVX組比較，ICA組、GEN組和E組全身骨密度均明顯升高（P＜0.05），而GEN組平均值高于ICA組。股骨骨密度結(jié)果與全身骨密度一致（Fig 2）。

2.3 血清OC和TRACP5b測定結(jié)果 1月齡大鼠口服淫羊藿苷后，與CON組相比，其血清OC水平明顯升高（P＜0.05），而GEN組無明顯變化。同時，ICA組平均值高于GEN組。6月齡大鼠切除卵巢后，與SHAM組比較，血清OC水平明顯降低。與OVX組比較，GEN組血清OC水平明顯升高（P＜0.05），而ICA組無明顯變化，且GEN組平均值高于ICA組（Tab 2）。

Fig 1 Result of total bonem ineral densityThe total bonemineral density of1-mo-old ratswere enhanced by oral icariin.And its average was higher than genistein.The total bone mineral density of6-mo-old ratswere enhanced by oral icariin.However，its average was lower than genistein（1-mo-old rat，n＝12，*P＜0.05 vs CON，＃P＜0.05 vs GEN；6-mo-old rat，n＝12，*P＜0.05 vs SHAM；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs OVX）

1月齡大鼠口服淫羊藿苷后，與CON組相比，其血清TRACP5b水平明顯降低（P＜0.05），而GEN組無明顯變化。同時，ICA組平均值低于GEN組。6月齡大鼠切除卵巢后，與 SHAM組比較，血清TRACP5b水平明顯升高（P＜0.01）。與OVX組比較，ICA組、GEN組血清TRACP5b水平明顯降低（P＜0.01），且ICA組平均值低于GEN組（Tab 2）。

2.4 組織微結(jié)構(gòu)結(jié)果 1月齡大鼠口服淫羊藿苷后，骨組織微結(jié)構(gòu)更加優(yōu)異，骨小梁數(shù)量和交聯(lián)度都提高，金雀異黃酮組雖然也有改善，但效果劣于淫羊藿苷。6月齡大鼠切除卵巢后，骨組織微結(jié)構(gòu)明顯退化，紅色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)減少，出現(xiàn)廣闊空白區(qū)域?？诜蜣杰?、金雀異黃酮后明顯改善，且金雀異黃酮組優(yōu)于淫羊藿苷組（Fig 3）。

Tab 2 Result of serum OC and TRACP5b concentration±s，n＝12）

Tab 2 Result of serum OC and TRACP5b concentration±s，n＝12）

1-mo-old rat，*P＜0.05 vs CON；6-mo-old rat，*P＜0.05，**P＜0.01 vs SHAM；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs OVX

G r o u p O C/μ g·L-1 T R A C P 5 b/U·L-1 1-m o-o l d C O N 6 9.9 4±1.3 8 0.6 9±0.1 5 I C A 7 1.0 3±1.1 7* 0.5 4±0.0 9*G E N 7 0.9 4±1.9 1 0.6 8±0.1 6 6-m o-o l d S H A M 1.4 1 2 9±0.0 0 0 3 0.4 8 8±0.0 1 O V X 1.4 1 2 3±0.0 0 0 7* 0.5 3 4±0.0 3**I C A 1.4 1 2 7±0.0 0 0 4 0.4 6 8±0.0 2＃＃G E N 1.4 1 2 9±0.0 0 0 1 0 3＃ 0.4 7 4±0.0 1 2＃＃E 1.4 1 2 8±0.0 0 0 1 1＃ 0.4 6 1±0.0 0 7＃＃

Fig 2 Result of femural bonem ineral densityThe femural bonemineral density of1-mo-old ratswere enhanced by oral icariin.And its averagewas higher than genistein.The femural bone mineral density of6-mo-old ratswere enhanced by oral icariin.However，its average was lower than genistein（1-mo-old rat，n＝12，**P＜0.01 vs CON，＃P＜0.05 vs GEN；6-mo-old rat，n＝12，**P＜0.01 vs SHAM，＃＃P＜0.01 vs OVX）

Fig 3 Bonem icroarchitectureBone trabeculae number and connection of1-mo-old ratswere best developed by oral icariin.However，Bone trabeculae number and connection of6-mo-old rats were best developed by oral genistein（n＝3）.

2.5 生物力學(xué)測定結(jié)果 如Fig 4所示，1月齡大鼠淫羊藿苷組與CON組相比，其最大載荷、彈性模量和屈服強(qiáng)度均提高（P＜0.05），金雀異黃酮組最大載荷和屈服強(qiáng)度均升高，彈性模量無統(tǒng)計學(xué)意義，同時，淫羊藿苷組最大載荷、彈性模量和屈服強(qiáng)度平均值均高于金雀異黃酮組。6月齡大鼠切除卵巢后，與SHAM組比較，最大載荷、彈性模量和屈服強(qiáng)度均降低（P＜0.01）。與OVX組比較，ICA組、GEN組最大載荷、彈性模量和屈服強(qiáng)度均升高（P＜0.05），而GEN組平均值均高于ICA組。

Fig 4 Result of femoral biomechanicsThe biomechanics of 1-mo-old rats were enhanced by oral icariin.And its average was higher than genistein.The biomechanics of6-mo-old rats were enhanced by oral icariin.However，its average was lower than genistein（1-mo-old rats，n＝12，*P＜0.05，**P＜0.01 vs CON；6-mo-old rats，n＝12，**P＜0.01 vs SHAM，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs OVX）

3 討論

骨質(zhì)疏松侵?jǐn)_億萬人的健康，強(qiáng)健的骨是晚年優(yōu)質(zhì)生活的必要，它與在青少年時獲得的峰值骨量相關(guān)，高峰值骨量減緩罹患骨質(zhì)疏松的風(fēng)險［5］。同時，絕經(jīng)期能通過藥物補(bǔ)充雌激素，抑制骨丟失，預(yù)防骨質(zhì)疏松，但雌激素替代療法出現(xiàn)患癌等嚴(yán)重副作用。金雀異黃酮臨危受命，近年來備受矚目，作為植物雌激素有望成為臨床抗骨質(zhì)疏松藥物，實驗大鼠常用劑量 10 mg·kg-1·d-1［6］。如果能尋找一種比金雀異黃酮藥效更強(qiáng)的植物雌激素或者雌激素樣作用的化合物，將為臨床提供更多選擇。淫羊藿苷是中醫(yī)常用壯骨藥物淫羊藿的提取物，有報道淫羊藿苷可預(yù)防絕經(jīng)后大鼠骨丟失［7］。本實驗淫羊藿苷和金雀異黃酮采用相同物質(zhì)的量的劑量，影響兩種不同年齡大鼠的骨量，研究防治骨質(zhì)疏松的效果。

1月齡大鼠灌服淫羊藿苷后，骨密度、骨組織微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)均提高，且其平均值均高于金雀異黃酮組。骨鈣素是成骨細(xì)胞特異性分泌的因子，淫羊藿苷提高血清骨鈣素含量的能力比金雀異黃酮更高。較強(qiáng)的骨密度、骨微結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能得益于淫羊藿苷更強(qiáng)的成骨性分化能力。換言之，淫羊藿苷提高峰值骨量的能力強(qiáng)于金雀異黃酮。然而，6月齡大鼠灌服淫羊藿苷后，骨密度、骨組織微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)雖均提高，但其平均值均低于金雀異黃酮組。同時，金雀異黃酮明顯提高骨鈣素，而淫羊藿苷無此效果。意味著金雀異黃酮抑制絕經(jīng)后骨量丟失的能力強(qiáng)于淫羊藿苷。綜上，淫羊藿苷相比較金雀異黃酮，在大鼠兩種不同的生理狀態(tài)表現(xiàn)出不同的藥理活性，峰值骨量在青春期獲得處于生長階段，促進(jìn)成骨性分化和礦化，有利于骨生長和骨量積累［8］。而切除卵巢后，體內(nèi)環(huán)境受制于雌激素，雌激素水平左右骨量，植物雌激素金雀異黃酮相比淫羊藿苷發(fā)揮更強(qiáng)的雌激素作用，預(yù)防骨量丟失。

通過研究淫羊藿苷和金雀異黃酮對兩種模型大鼠骨量的影響，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷提高峰值骨量的活性強(qiáng)，金雀異黃酮抑制絕經(jīng)后骨量丟失的活性強(qiáng)。即淫羊藿苷有更強(qiáng)的成骨活性，而金雀異黃酮有更強(qiáng)的雌激素活性。這種不同的雌激素和成骨活性的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Okano T.Effects of essential trace elements on bone turnover-in relation to the osteoporosis［J］.Nihon Rinsho，1996，54（1）：148-54.

［2］ 安 珍，程 靜，王文志，等.峰值骨量與骨質(zhì)疏松癥 ［J］.現(xiàn)代康復(fù)，2001，5（2）：152-4.

［2］ An J，Cheng J，WangW Z，et al.Peak boneount and osteoporosis［J］.Mod Rehabil，2001，5（2）：152-4.

［3］ Hsieh T P，Sheu SY，Sun JS，etal.Icariin isolated from Epimedium pubescens regulates osteoblasts anabolism through BMP-2，SMAD4，and Cbfa1 expression［J］.Phytomedicine，2010，17（6）：414-23.

［4］ Ma H P，Ming L G，Song P，et al.Icariin is more potent than genistein in promoting osteoblast differentiation and mineralization in vitro［J］.JCell Biochem，2011，112（3）：916-23.

［5］ Kaludjerovic J，Ward W E.Neonatal exposure to daidzein，genistein，or the combination modulates bone development in female CD-1 mice［J］.JNutrition，2009，139（3）：467-73.

［6］ Picherit C，Coxam V，Bennetau-Pelissero C，et al.Daidzein is more efficient than genistein in preventing ovariectomy-induced bone loss in rats［J］.JNutrition，2000，130（7）：1675-81.

［7］ Bao J，Yang J，LiS，etal.Effectsof Icariin on ovariectomized osteoporotic rats［J］.JHygiene Res，2005，34（2）：191.

［8］ Mardon J，Mathey J，Kati-Coulibaly S，et al.Influence of lifelong soy isoflavones consumption on bonemass in the rat［J］.Exp Biol Med，2008，233（2）：229-37.