尼可地爾、谷氨酰胺、美托洛爾單獨及合用對大鼠心肌缺血/再灌注損傷后心肌細胞抗凋亡和HSP70的影響

陳文華，孫 暢，張 穎，吳艷娜，溫 克，康 毅，婁建石

（天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，天津 300070）

心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI）即當心肌較長時間缺血造成一定程度損傷后，恢復供血不但不能減輕或逆轉損傷，反而加重損傷。MIRI表現為心肌舒縮功能降低、心肌結構損壞、心律失常、心肌能量代謝障礙和超微結構變化等。1986年，Murry等首次提出“缺血預適應”（ischemia preconditioning，IPC）的概念，即反復短暫的心肌缺血會對心肌產生保護作用，使心肌對更長時間缺血的耐受性增強［1］。目前認為，IPC是一種非常有效的內源性保護機制，可刺激機體合成、釋放內源性活性物質?；趯@種保護性機制的認識，研究人員用藥物激發(fā)或模擬機體內源性活性物質，以呈現IPC樣保護作用，稱為藥理性預適應（pharmacological preconditioning，PP）。缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷的發(fā)生機制較為復雜，但目前國內外報道的藥理性預適應大多仍是單藥物、單機制、單方面的。所以，針對這種情況，研究人員開始嘗試聯合用藥防治I/R損傷。細胞凋亡是MIRI的特征性改變［2-3］，細胞凋亡的數量決定著I/R損傷的輕重。熱休克蛋白［4］（heat shock protein，HSP）是機體在多種損傷性應激原（如熱休克、缺血、創(chuàng)傷、病原體感染）應激狀態(tài)下產生的一類內源性保護蛋白。HSP70作為其中一個亞型，在防止應激引起的細胞損害以及修復受損的細胞方面發(fā)揮著重要的作用［5］。因此，本實驗采用尼可地爾、美托洛爾、谷氨酰胺三種藥物，觀察單獨用藥與聯合用藥對大鼠MIRI后心肌細胞抗凋亡能力和保護性蛋白HSP70表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品與試劑 尼可地爾（陜西力邦制藥公司，批號：030604）；美托洛爾（天津市藥物研究院，批號：091203）；丙氨酰谷氨酰胺注射液（華瑞制藥有限公司，批號：80DK32）；RIPA組織/細胞裂解液（北京普利萊基因技術有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天，批號：201211043）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天，批號：201201022）；鼠單克隆抗體β-actin（Santa Cruz）；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記山羊抗兔IgG、兔抗鼠Bcl-2均購自 Santa Cruz（批號分別為：96996、97380、J2511）；兔抗鼠Bax（Abcam分裝，批號：70163）；原位細胞凋亡檢測試劑盒（Roche，德國）；蛋白酶 K（Roche，德國）；鼠單克隆抗體 HSP70（Santa Cruz，批號：3097-100）。

1.1.2 儀器 BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；HX-100E小動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）；外科手術器械（上海醫(yī)療器械有限公司）；電泳儀和電泳槽（BIO-RAD，USA）；WK-9580B型水平搖床（北京六一儀器有限公司）；2050型自動石蠟切片機（Sigma，德國）；H22110型切片烘干機（Leica，德國）。

1.1.3 實驗動物及分組 Wistar♂健康大鼠104只，體質量（250±10）g，SPF級，實驗動物質量合格許可證號：SCXK-（軍）2012-0004，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為7組。①假手術組（Sham group，n＝8）：麻醉后開胸手術前，腹腔注射 NS（5ml·kg-1，與給藥組等體積），30min后實施開胸手術、冠狀動脈LAD穿線，不結扎；②缺血/再灌注損傷組（I/R group，n＝16）：麻醉后開胸手術前，腹腔注射NS（5 ml·kg-1，與給藥組等體積），30 min后實施I/R程序；③ 尼可地爾組（Nic group，n＝16）：麻醉后開胸手術前，腹腔注射給予1 mg·kg-1即 1 ml·kg-1（藥物濃度為 1 g·L-1）的Nic＋4 ml·kg-1NS，30 min后實施 I/R程序；④ 谷氨酰胺組（Glu group，n＝16）：麻醉后開胸手術前，腹腔注射給予1 mg·kg-1（藥物濃度為1 g·L-1）的 Glu＋4 ml·kg-1NS，30 min后實施 I/R程序；⑤美托洛爾組（Met group，n＝16）：麻醉后開胸手術前，腹腔注射給予1mg·kg-1即1ml·kg-1（藥物濃度為 1 g·L-1）的 Met＋4 ml·kg-1NS，30 min后實施I/R程序；⑥ 三藥聯用組（NGM group，n＝16）：麻醉后開胸手術前，腹腔注射給予1 ml·kg-1Nic＋1 ml·kg-1Glu＋1 ml·kg-1Met＋2 ml·kg-1NS，30 min后實施I/R程序；⑦三藥聯用低劑量組（NGML group，n＝16）：麻醉后開胸手術前，按 NMG組劑量的1/2腹腔注射給藥，30 min后實施I/R程序。

1.2 方法

1.2.1 心肌缺血/再灌注損傷模型的建立 ♂Wistar大鼠用25%烏拉坦（1 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，仰位固定于手術臺。連接BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)，監(jiān)測體表心電圖。行頸總動脈插管、氣管插管，連接小動物呼吸機。于胸骨左緣3 mm處縱向剪開胸部皮膚，鈍性分離肌肉，止血鉗于第4、5肋間開胸，剪開心包，暴露心臟。以左冠狀靜脈為標志，從左心耳下緣1 mm處進針，經LAD下，于肺動脈圓錐旁出針。收緊結扎線，阻斷LAD血流，造成心肌缺血；心肌缺血30 min后，松開結扎線，恢復血液灌注，進行再灌注2 h程序。

1.2.2 藥物預處理（PP）模型的建立 大鼠麻醉后，腹腔注射給予相應的藥物，觀察并記錄心電圖變化，30 min后行開胸手術，實施心肌缺血30 min，再灌注2 h程序。

1.2.3 TUNEL法檢測細胞凋亡 心臟LAD冠脈再灌注120 min時迅速取下心臟，取中下1/3部分于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于檢測細胞凋亡。經TUNEL染色，凋亡陽性心肌細胞核被染成棕黃色，非凋亡心肌細胞核為藍色。每只大鼠觀察2張切片，每張切片分別計數5個高倍鏡視野（400×）中的凋亡陽性細胞核數和總細胞核數，并各取平均值，凋亡陽性細胞核數與總細胞核數的比值作為心肌細胞凋亡指數（apoptosis index，AI）。

1.2.4 Western blot法檢測大鼠心肌細胞Bcl-2、Bax、HSP-70的表達 心臟LAD冠脈再灌注120 min時迅速取下心臟，垂直于心臟長軸方向，取中上2/3左心室前壁心肌組織用于檢測。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 計量資料以ˉx±s表示，均數間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。單因素方差分析總體上存在顯著性差異，方差齊時，組間比較采用LSD法；方差不齊時，采用秩和檢驗法。所有分析均使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析。

2 結果

2.1 尼可地爾、美托洛爾、谷氨酰胺單獨及聯合用藥對大鼠I/R損傷后心肌細胞凋亡的影響 I/R組中有大量的凋亡細胞，單用及聯合用藥組中凋亡細胞則明顯減少。I/R組細胞凋亡率明顯高于Sham組，表明I/R損傷后細胞凋亡明顯；而NGM組細胞凋亡率明顯低于I/R組，表明聯合用藥可以抵抗I/R損傷引起的細胞凋亡；與藥物單用組相比，NGM組細胞凋亡率明顯降低，表明聯合用藥可以從多個方面抑制細胞凋亡。見Fig 1，2。

2.2 尼可地爾、美托洛爾、谷氨酰胺單獨及聯合用藥對大鼠I/R損傷后Bcl-2、Bax表達的影響 I/R組與Sham組相比Bcl-2的表達較少，各藥物預處理組與I/R組相比Bcl-2的表達均明顯增加，但與藥物單用組相比，NGM組Bcl-2表達增加更多；I/R組較Sham組Bax表達明顯增加，藥物預處理組與I/R組相比Bax表達均明顯降低，與藥物單用組相比，NGM組和NGML組Bax表達更低（P＜0.01）；I/R組的Bcl-2/Bax值最小，約為Sham組的22%；藥物預處理組的Bcl-2/Bax值均有所增加，以NGM組增幅最大，且與單用藥物組以及NGML組的差異存在統(tǒng)計學意義。見Fig 3～5。

Fig 1 Changes of apoptosis determ ined by TUNEL in rat cardiomyocytes after I/R injury in each experimental group（400×）A：Sham；B：I/R；C：Nic；D：Glu；E：Met；F：NGM：G：NGML.

Fig 3 Bcl-2 andβ-actin ofm yocardial cells by W estern blot

Fig 4 Bax andβ-actin ofmyocardial cells by Western blot

Fig 5 Changes of Bcl-2/Bax in rat cardiomyocytes after I/R injury in each experimental group**P＜0.01 vs sham；△△P＜0.01 vs I/R；＃＃P＜0.01 vs NGM

2.3 尼可地爾、美托洛爾、谷氨酰胺單獨及聯合用藥對大鼠I/R損傷后HSP 70表達的影響 與Sham組相比，I/R組HSP70的表達略有增加；與I/R組相比，各藥物單用組以及聯合用藥組HSP 70的表達均明顯增加，尤以NGM組增幅最大，約為I/R組的2.4倍。見Fig 6，7。

Fig 6 HSP 70 andβ-actin ofm yocardial cells by W estern blot

3 討論

細胞凋亡是1972年由Kerr教授根據形態(tài)學特征首先提出的，它是指為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主有序的死亡［6］。細胞凋亡有著非常復雜的調控機制，其中Bcl-2基因家族是目前研究較多的與細胞凋亡密切相關的基因，Bcl-2與Bax基因均屬于Bcl-2基因家族，但兩者的作用相反，Bcl-2為抑制細胞凋亡的基因，而Bax為促進細胞凋亡的基因。研究結果表明，Bcl-2/Bax比值的大小可反映Bcl-2和Bax在細胞凋亡中的作用，若Bcl-2/Bax比值較高，則抑制細胞凋亡；反之，Bcl-2/Bax比值較低，則促進細胞凋亡［7-8］。本實驗采用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡率［9］；Western blot法檢測凋亡調節(jié)蛋白和心肌細胞HSP70的表達，評價I/R過程中聯合用藥預處理對細胞凋亡的保護作用。本實驗研究結果顯示：I/R組缺血區(qū)的細胞凋亡率較高，采用藥物預處理可以降低細胞凋亡率；I/R組凋亡相關蛋白表達Bcl-2/Bax值較低，采用藥物預處理組可以使Bcl-2/Bax值升高。由此結果我們可以看出，尼可地爾、谷氨酰胺、美托洛爾單獨及聯合用藥可以減少大鼠心肌缺血/再灌注損傷后心肌細胞的凋亡。

MIRI過程中細胞凋亡的主要機制［10］為：①凋亡相關基因的調控，如Bcl-2家族、p53、Fas抗原等；②中性粒細胞浸潤、氧自由基損傷、細胞內鈣超載，細胞因子的大量表達等。HSP70發(fā)揮保護作用的機制［11-12］主要為：通過結合因缺血而受損的蛋白，修復并維持其結構的穩(wěn)定性；維護心肌鈣離子的穩(wěn)定；保護心肌線粒體功能；調節(jié)敏感性鉀通道活性等。

尼可地爾［13］的抗心肌細胞凋亡作用與KATPC的開放有關，它是一種非選擇性的KATPC開放劑，可同時開放細胞膜和線粒體內膜上的KATPC［14］。美托洛爾一方面通過抑制心肌細胞β受體，降低心肌收縮力，減慢心率，抑制交感神經和中性粒細胞激活，減輕鈣超載，達到抗凋亡作用［15］；另一方面，美托洛爾能減少Fas、caspase-3、p53等凋亡相關蛋白的表達。氧自由基是心肌缺血/再灌注損傷的重要因素之一，谷氨酰胺一方面能夠通過誘導谷胱甘肽的合成保護心肌細胞免受氧化應激的損傷，另一方面也能夠提供谷胱甘肽的前體從而增加心肌組織氧自由基的清除，有利于心肌缺血/再灌注后心肌細胞的恢復；許多研究表明，谷氨酰胺還可以增加HSP的表達，達到對抗應激刺激起到保護細胞的［16］。HSP70對細胞凋亡的死亡受體通路和線粒體通路均有抑制作用［17］。

綜上所述，聯合用藥通過增加氧自由基的清除，減輕心肌細胞鈣超載，保護線粒體，調節(jié)凋亡相關基因Bcl-2、Bax的表達，誘導心肌缺血預適應，增加保護性蛋白HSP70的表達等途徑作用在心肌缺血/再灌注損傷的各個環(huán)節(jié)；從缺血預適應、心肌細胞能量代謝和抑制細胞凋亡三個層面，達到協(xié)同抗凋亡作用。

Fig 7 Changes of HSP protein expresion determ ined by Western blot in rat cardiomyocytes after I/R injury in each experimental group（%ofβ-actin）**P＜0.01 vs Sham；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs I/R；＃＃P＜0.01 vs NGM

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