ABCB5和MDR1對急性髓系白血病耐藥的影響

李真真，張曉龍，楊雨琪，張 晴，袁向飛，范冬梅

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院·北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300020，2.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津 300070）

急性髓系白血?。╝cutemyeloid leukemia，AML）化療失敗及復(fù)發(fā)的主要原因是白血病細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象（MDR）［1］，即腫瘤細(xì)胞接觸一種化療藥物繼而產(chǎn)生耐藥的同時(shí)，對多種結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制各異的其它化療藥物也產(chǎn)生交叉耐受性；而MDR的最經(jīng)典機(jī)制是腫瘤細(xì)胞高表達(dá)ATP-binding cassette（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，如P-gp（其編碼基因?yàn)槟[瘤多藥耐藥基因MDR1），高表達(dá)的P-gp可以利用水解ATP的能量將各種藥物從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，降低藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度，并使其細(xì)胞毒作用減弱直至消失［2］。臨床上，MDR1基因及其表達(dá)產(chǎn)物P-gp的高表達(dá)與腫瘤化療耐藥、復(fù)發(fā)和預(yù)后差等密切相關(guān)。Liu等［3］研究發(fā)現(xiàn)10例復(fù)發(fā)B細(xì)胞淋巴瘤患者中8例MDR1/P-gp高表達(dá)，14例對照組患者中4例MDR1/P-gp高表達(dá)；其中對照組中MDR1陽性者生存時(shí)間明顯低于陰性者（分別為12.7和29.0個(gè)月）；同樣的，有近50%的AML患者其白血病細(xì)胞高表達(dá) MDR1（ABCB1；P-gp），并往往伴隨著復(fù)發(fā)以及預(yù)后差等現(xiàn)象［4］。所以，理論上講，針對P-gp的藥物泵抑制劑能夠極大程度的逆轉(zhuǎn)AML的MDR現(xiàn)象并改善病人預(yù)后［5-6］，但是，也有部分臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示：聯(lián)用外排泵抑制劑并未能明顯改善病人預(yù)后［7］。我們推測在AML白血病細(xì)胞表面可能還有其它外排泵的表達(dá)。

ABCB5是近些年發(fā)現(xiàn)的表達(dá)于某些黑色素瘤表面的ABC超家族另一成員，在CD133＋的亞群細(xì)胞中高表達(dá)，被認(rèn)為是黑色素瘤腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志之一，并且與疾病的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)［8］；作為外排泵，ABCB5與腫瘤細(xì)胞耐受蒽環(huán)類抗生素及紫杉醇類藥物相關(guān)［9］。另外，Wilson等［10］研究也發(fā)現(xiàn)，ABCB5可以作為結(jié)腸癌患者中難治并導(dǎo)致復(fù)發(fā)的腫瘤干細(xì)胞的分子標(biāo)志。這些結(jié)果表明，ABCB5在實(shí)體瘤，尤其是惡性黑色素瘤及結(jié)腸癌的耐藥及復(fù)發(fā)，乃至腫瘤干細(xì)胞中扮演重要角色。目前，關(guān)于ABCB5在血液系統(tǒng)的研究還很少，僅Frank等［11］在耐長春新堿的細(xì)胞株K562VCR中發(fā)現(xiàn)ABCB5的高表達(dá)，并伴隨著白血病干細(xì)胞相關(guān)基因的激活，說明ABCB5也許代表著白血病干細(xì)胞的一種可能耐藥機(jī)制。本研究以來源于AML的干祖細(xì)胞系KG1a為例，旨在探討AML相關(guān)的耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑 KG1a購自ATCC，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫。IMEM培養(yǎng)基粉末、胎牛血清、胰酶購自Gibco公司；lipo2000、TRIzol、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 Invitrogen；MTT、鹽酸阿霉素（ADR）、維拉帕米（Vera）、Rhodamine123、DMSO購自Sigma公司；SYBR Premix購自TaKaRa；RIPA細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF購自江蘇海門碧云天生物研究所；P-gp直標(biāo)抗體、PE二抗購自BD公司；ABCB5抗體購自Abcam。

1.2 病人標(biāo)本 71例來源于AML病人外周血單個(gè)核由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院提供，病人及家屬均知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) KG1a細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的IMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱，每2～3天傳代1次；取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的KG1a細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×108·L-1后接種于6孔板中，4×105個(gè)/孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；次日轉(zhuǎn)染之前更換無血清培養(yǎng)基，然后分別用250μl opti-MEM稀釋100 pmol siRNA和5μl lipo2000，室溫放置5 min后，將二者混合，室溫孵育20 min，最后把混合物加入預(yù)先更換培養(yǎng)基的KG1a細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h后更換為含10%FBS的IMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后48 h或72 h進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)。人源ABCB5的siRNA靶序列為 5′-GCTGGAAAGATAGCAACTGAA-3′（1 828 bp-1 848 bp），由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.3.3 Western blot檢測KG1a細(xì)胞中ABCB5及P-gp的表達(dá)情況 取對數(shù)生長期的KG1a及轉(zhuǎn)染siRNA后48 h的KG1a細(xì)胞，RIPA裂解后提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后用于Western blot檢測。先進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜，封閉后 2 h分別孵育 ABCB5抗體（1∶1 000稀釋）、P-gp抗體（1∶1 000稀釋）及GAPDH抗體（1∶2 000稀釋），4℃過夜，PBST洗滌3次，每次10 min；再與二抗室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，每次10 min，化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面ABCB5及P-gp的表達(dá) 取對數(shù)生長期的KG1a細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌兩次，加入P-gp直標(biāo)抗體，室溫避光孵育0.5 h，應(yīng)用BD LSRⅡ數(shù)字化分析型流式細(xì)胞儀檢測和分析數(shù)據(jù)；取對數(shù)生長期的KG1a，預(yù)冷的PBS洗滌兩次，預(yù)冷的80%甲醇固定細(xì)胞5 min，0.3 mol·L-1甘氨酸封閉細(xì)胞30 min，加入ABCB5抗體室溫孵育1 h，加入PE二抗后，室溫避光孵育30 min，上機(jī)檢測。

1.3.5 Rhodamine123檢測外排泵功能 取對數(shù)生長期的KG1a，預(yù)冷PBS洗滌兩次，維拉帕米組預(yù)先加入終濃度為25 mg·L-1的維拉帕米37℃水浴震蕩培養(yǎng)30 min，然后與其它實(shí)驗(yàn)組一起加入2 ml含終濃度為100μg·L-1的Rhodamine123的無血清培養(yǎng)基，37℃水浴震蕩培養(yǎng)90 min，離心棄上清，500 μl PBS重懸，F(xiàn)ITC通道檢測細(xì)胞內(nèi)蓄積的熒光強(qiáng)度。

1.3.6 MTT法檢測細(xì)胞對化療藥物敏感性 取對數(shù)生長期或轉(zhuǎn)染siABCB5后48 h的KG1a細(xì)胞，接種于96孔板，1×104個(gè)細(xì)胞/孔，24 h后，加入不同濃度的藥物，每個(gè)藥物梯度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，然后置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，加入終濃度為0.5 g·L-1MTT，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱避光孵育4 h，然后棄上清，加入150μl DMSO，振蕩溶解甲臜，用酶標(biāo)儀測定570 nm的光吸收值。

1.3.7 Real-Time PCR的方法在mRNA水平檢測ABCB5及P-gp的表達(dá) 取臨床病人外周血標(biāo)本，加入15 ml的生理鹽水洗1遍后重懸，然后緩慢加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液，室溫2 000 r·min，離心15 min，用細(xì)的玻璃滴管吸取中間的白膜，生理鹽水洗1遍后加入TRIzol裂解液混勻，提取細(xì)胞總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將得到的cDNA模板用去離子水稀釋5～10倍后用于Real-Time PCR，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；60℃延伸34 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線反應(yīng)條件95℃變性1 min，60℃復(fù)性1 min；應(yīng)用 Applied Biosystems 7500 software分析數(shù)據(jù)。ABCB5引物為：上游5′-GCTGAGGAATCCACCCAATCT-3′，下游 5′-CACAAAAGGCCATTCAGGCT-3′；P-gp引物為：上游 5′-TGCTCAGACAGGATGTGAGTTG-3′，下游 5′-AATTACAGCAAGC CTGGAACC-3′；人 源 GAPDH 引 物 為：上 游 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′，下 游 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，由Invitrogen公司北京合成部合成。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，結(jié)果重復(fù)3次，顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ABCB5及P-gp在急性髓系白血病細(xì)胞系KG1a細(xì)胞中高表達(dá) 采用FACS的方法，在蛋白水平上檢測急性髓系白血病干祖細(xì)胞系KG1a細(xì)胞表面P-gp及ABCB5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)二者在KG1a細(xì)胞表面表達(dá)量均較高，陽性率都接近100%（Fig 1 AB，C-D）；若用熒光強(qiáng)度代表各自的相對表達(dá)水平，那么P-gp的表達(dá)量明顯高于ABCB5（P＜0.01），為ABCB5的3.7倍。Western blot的方法分析結(jié)果與上述結(jié)果一致，ABCB5及P-gp在KG1a中均為特異高表達(dá)（Fig 1E）。

Fig 1 Expression of ABCB5 and P-gp in KG1a cellsThe relative expression of ABCB5 and P-gp on the surface of KG1a cells wasmeasured by FACS（A-D）.A：The isotype control for ABCB5；B：ABCB5 antibdoy；C：The isotype control for P-gp；D：P-gp antibody；E：The expression of ABCB5 and P-gp in KG1a cells was analyzed by Western blot.

2.2 siABCB5瞬時(shí)干擾降低KG1a中ABCB5的表達(dá)水平 特異的siABCB5轉(zhuǎn)染KG1a 72 h后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot分析其蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對照組（轉(zhuǎn)染亂序siRNA）相比，siABCB5組ABCB5蛋白表達(dá)水平明顯降低（Fig 1E），說明特異的siABCB5可以有效地干擾并降低ABCB5的表達(dá)。

2.3 ABCB5和P-gp共同參與介導(dǎo)KG1a對化療藥物的外排 外排泵P-gp和ABCB5可以利用水解ATP的能量將各種藥物從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，使藥物在細(xì)胞內(nèi)濃度不斷下降。Rho123是一種可以通過細(xì)胞膜的熒光染料，也是外排泵P-gp和ABCB5的底物，所以其可用于檢測外排泵的功能；維拉帕米是外排泵抑制劑。KG1a的外排實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：外排泵抑制劑維拉帕米預(yù)處理后，KG1a細(xì)胞內(nèi)Rho123熒光強(qiáng)度與未處理組相比明顯增加（Fig 2 b-c）說明維拉帕米抑制外排泵P-gp和ABCB5的功能，從而增加了細(xì)胞內(nèi)Rho123的蓄積；而干擾ABCB5組胞內(nèi)Rho123蓄積量介于維拉帕米未處理組和處理組之間（Fig2 b-d），說明 P-gp和 ABCB5共同參與KG1a對化療藥物的耐受機(jī)制。

Fig 2 Intracellular rhodam ine 123 weremeasured by FACS to reflect function of efflux pumpa：A negative control for KG1a；b：KG1a cells；c：KG1a cells pretreated with verapamil as a positive control；d：siABCB5-KG1a cells；cell in b，c，d were incubated with rhodamine123 for90min respectively.

2.4 干擾ABCB5的表達(dá)可以提高KG1a對化療藥物的敏感性 維拉帕米對KG1a的EC50為（75.99±2.71）μmol·L-1（Fig 3A），我們選取對細(xì)胞生長無明顯影響的劑量10μmol·L-1與化療藥物阿霉素聯(lián)用，觀察兩者的聯(lián)用效果。結(jié)果顯示：單獨(dú)阿霉素組 KG1a的 EC50為（5.8±1.4）μmol·L-1；而聯(lián)用無毒劑量維拉帕米組，其EC50降低為（0.086±0.013）μmol·L-1，換言之，聯(lián)用無毒劑量維拉帕米使KG1a對阿霉素的敏感性提高67.4倍；干擾ABCB5組其 EC50降低為（0.67±0.12）μmol·L-1，對阿霉素的敏感性提高8.6倍。

Fig 3 Sensitivity of KG1a or siABCB5-KG1a for ADR detected by MTTA：KG1a cells were exposed to various concentrations of verapamil for 72h to confirm a safe dose for KG1a；B：KG1a cells，KG1a cells pretreated with verapamil or si ABCB5-KG1a cells were exposed to various concentrations of ADR for 72 h.

Fig 4 ABCB5 gene expression in samples from AML and correlation between ABCB5 and MDR1 gene expressionA：The expression of ABCB5 in samples from AML and healthy donorswere detected by real-time PCR；B：The expression of ABCB5 in relapse/refractory and drug sensitive AML samples；C：The correlation between ABCB5 and MDR1 gene expression.**P＜0.01 vs PBL；＃＃P＜0.01 vs relapse/refractory.

2.5 ABCB5在AM L病人標(biāo)本中高表達(dá)，并與MDR1的表達(dá)水平成正相關(guān) 檢測71例來源于AML病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中ABCB5的表達(dá)水平，結(jié)果顯示其在AML病人細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞（P＜0.01）（Fig 4A）；其中，38例為復(fù)發(fā)或難治型病例，其余33例為化療敏感型病例，而ABCB5在復(fù)發(fā)或難治型病例中的表達(dá)水平明顯高于化療敏感型（P＜0.01）（Fig 4 B）；另外，在38例復(fù)發(fā)或難治型病例中ABCB5的mRNA表達(dá)水平與MDR1的表達(dá)水平成正相關(guān)（Fig 4C）。

3 討論

AML是以外周血、骨髓和（或）組織內(nèi)的髓系原始細(xì)胞克隆性增殖為特征的異質(zhì)性造血系統(tǒng)惡性腫瘤，是成年人最常見的急性白血病。盡管化療和支持治療的方法不斷進(jìn)展，多數(shù)患者經(jīng)誘導(dǎo)化療后可達(dá)到完全緩解，但一部分患者最終還會(huì)復(fù)發(fā)，5年總生存率僅為40%～50%［12］。而復(fù)發(fā)及難治的根源在于患者對化療藥物產(chǎn)生MDR，研究表明，AML患者中MDR1及蛋白表達(dá)產(chǎn)物P-gp通常是高表達(dá)的，并往往伴隨著療效差及預(yù)后不佳［4］。而臨床上化療藥物聯(lián)合針對P-gp的外排泵抑制劑的療效并沒有達(dá)到預(yù)期效果，如二代P-gp抑制劑valspodar或PSC-833，與化療藥物聯(lián)用治療復(fù)發(fā)或難治的AML沒有明顯提高緩解率及長期存活率［13-14］；僅有1例環(huán)孢素 A（P-gp競爭調(diào)節(jié)劑）的臨床試驗(yàn)（SWOG9126）的結(jié)果顯示：聯(lián)用環(huán)孢素A的AML患者可以獲得更長時(shí)間的存活［15］；而使用3代P-gp抑制劑zosuquidar，也并未明顯延長患者生存時(shí)間或提高緩解率［7］。上述結(jié)果提示，介導(dǎo)AML的耐藥機(jī)制可能不僅僅由于P-gp的參與，或許涉及更廣范圍的ABC超家族成員或其它耐藥分子機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，除P-gp之外，有另一重要分子ABCB5參與介導(dǎo)AML的耐藥現(xiàn)象：ABCB5在AML細(xì)胞系KG1a中高表達(dá)；而用siRNA的方法成功降低ABCB5的表達(dá)后，siABCB5-KG1a表現(xiàn)出外排功能減弱，胞內(nèi)藥物蓄積增多，從而提高其對化療藥物阿霉素的敏感性；另外，在71例來源于AML的臨床標(biāo)本中，ABCB5的表達(dá)水平明顯高于健康組，其中復(fù)發(fā)和難治的白血病標(biāo)本中ABCB5的表達(dá)量明顯高于化療敏感的病人標(biāo)本，并且其ABCB5的表達(dá)水平與MDR1表達(dá)量成正相關(guān)。揭示了ABCB5與急性白血病的進(jìn)展以及難治和耐藥的關(guān)系，ABCB5可能成為針對AML耐藥的新靶點(diǎn)。

ABCB5最早被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)節(jié)表皮黑色素祖細(xì)胞的融合，同時(shí)與其它ABC超家族成員一樣，也有外排泵的功能［8］，介導(dǎo)黑色素瘤［16］、結(jié)腸癌［10］等腫瘤細(xì)胞對蒽環(huán)類抗生素及紫杉醇類藥物的耐受；另外，有研究［8-10］認(rèn)為，ABCB5可作為惡性黑色素瘤腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志，靶向ABCB5的治療策略可以抑制腫瘤的形成，并且其在腫瘤形成、進(jìn)展以及化療耐藥方面都發(fā)揮了重要作用。那么，ABCB5作為聯(lián)系腫瘤干細(xì)胞、多藥耐藥以及腫瘤預(yù)后的一個(gè)重要分子，它將成為難治及復(fù)發(fā)腫瘤的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。而本研究結(jié)果成為上述結(jié)果的延續(xù)，我們發(fā)現(xiàn)，ABCB5與P-gp一樣，在常見的血液系統(tǒng)疾病AML的耐藥及復(fù)發(fā)中有重要作用，并且與病人預(yù)后密切相關(guān)。臨床上單獨(dú)靶向外排泵P-gp并未明顯改善療效，而這些結(jié)果提示我們針對ABCB5及P-gp雙靶點(diǎn)或許能夠改善AML病人的緩解率及長期存活率，這些有待進(jìn)一步的研究結(jié)果支持。

綜上所述，ABCB5參與介導(dǎo)AML的耐藥及復(fù)發(fā)，并與P-gp的表達(dá)以及病人預(yù)后成正相關(guān)，為AML的臨床治療提供潛在的新的靶點(diǎn)。目前研究認(rèn)為，AML的復(fù)發(fā)耐藥是由于白血病干細(xì)胞的殘留導(dǎo)致的，而本研究關(guān)于ABCB5與白血病干細(xì)胞的內(nèi)在聯(lián)系仍然未知，這也是我們今后深入研究的方向，為AML臨床治療奠定基礎(chǔ)。

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