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    響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取毛花獼猴桃根中三萜類化合物的工藝研究

    2014-05-17 00:43:42林水花吳建國(guó)鄭燕枝吳巖斌鄒秀紅吳錦忠
    關(guān)鍵詞:毛花三萜類三萜

    林水花,吳建國(guó),鄭燕枝,吳巖斌,鄒秀紅,吳錦忠*

    1福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;2福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院,福州350108;3福建省永春縣林業(yè)局,永春362600

    毛花獼猴桃(Actinidia eriantha Benth.),又名白毛桃、毛冬瓜、白藤梨,其根、根皮和葉均可入藥,主要分布在浙江、江西、福建、湖南等地,資源豐富。民間用其根治療肺熱失音,大頭瘟,濕熱帶下,乳癰,胃癌,鼻癌,乳癌等[1]。研究表明毛花獼猴桃根主要含有三萜類等化學(xué)成分[2,3],具有廣泛的生物活性如抗炎、抗腫瘤等[4],三萜類化合物的抗腫瘤作用機(jī)制也多種多樣,如抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤血管生成,抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶活性等[5]。

    超聲提取方法是一種新技術(shù),具有低溫、高效、能夠節(jié)省溶劑等優(yōu)點(diǎn),有利于提取不受熱和不穩(wěn)定的成分[6]。本文采用超聲輔助提取的方法,根據(jù)單因素考察結(jié)果結(jié)合響應(yīng)面分析法對(duì)毛花獼猴桃根中的總?cè)铺崛」に囘M(jìn)行優(yōu)化,為毛花獼猴桃根的進(jìn)一步開發(fā)與研究提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 藥材與試劑

    毛花獼猴桃根采自福建永春藥材市場(chǎng),經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊成梓副教授鑒定為獼猴桃科植物毛花獼猴桃(Actinidia eriantha Benth.)的根。乙醇、高氯酸(天津福晨化學(xué)試劑廠)和香草醛、冰乙酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)均為分析純;熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào):110742-200517)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    LK-1000A搖擺式中藥粉碎機(jī)(上海隆拓儀器設(shè)備有限公司);SFG-02B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司);AB204-N電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);KQ-500E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DLSD-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);HH-S型水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);UV-1800紫外可見分光光度計(jì)(日本島津儀器有限公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    精密稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg于10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯溶液溶解并定容至刻度,搖均,配置成含熊果酸0.25 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別精密量取對(duì)照品溶液 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL置于10 mL容量瓶中,水浴加熱,除去溶劑后加入0.5 mL 5%香草醛-冰乙酸及1.2 mL高氯酸,混勻,密塞,置70℃恒溫水浴加熱15 min,取出冰浴冷卻至室溫,乙酸乙酯定容,搖均。以相應(yīng)試劑溶液為空白對(duì)照,于550 nm測(cè)定吸光值,以吸光度為眾坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得 Y=0.07465X+0.02193,R2=0.99995。結(jié)果表明,三萜酸在濃度為5.0μg/mL至17.5μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

    1.3.2 樣品制備及含量測(cè)定

    準(zhǔn)確稱取毛花獼猴桃根粉末10.0 g,乙醇超聲提取,回收溶劑,提取液在水浴鍋上干燥至恒重。精密稱取干燥至恒重提取物10 mg,用甲醇溶解并定容至25 mL,提取物溶液濃度為0.4 mg/mL。按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法進(jìn)行三萜酸含量測(cè)定,計(jì)算毛花獼猴桃根中總?cè)频暮?mg/g)。

    1.3.3 方法學(xué)考察

    1.3.3.1 精密度實(shí)驗(yàn)

    分別精密量取熊果酸對(duì)照品溶液0.3 mL及提取物溶液1 mL,于10 mL容量瓶中。按2.6方法測(cè)定總?cè)坪浚謩e連續(xù)測(cè)量6次???cè)坪康腞SD分別為1.80%和1.90%,表明儀器精密度良好。

    1.3.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    分別精密量取熊果酸對(duì)照品溶液0.3 mL和提取物溶液1 mL,于10 mL容量瓶中。按1.3.1方法操作,分別于 0、15、30、45、60、75、90 min 測(cè)定吸光度值。總?cè)坪康?RSD分別為 1.37%和1.38%,表明樣品在90 min內(nèi)穩(wěn)定。

    1.3.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

    精密稱取藥材粉末2 g,共6份,分別加入30 mL 75%的乙醇溶液,浸泡20 min,超聲提取45min,提取功率500 W。提取兩次,過(guò)濾,合并提取液,再按1.3.1項(xiàng)下操作,測(cè)定吸光度值???cè)坪康腞SD為3.29%,表明方法重復(fù)性好。

    1.3.3.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

    精密稱取同一批藥材粉末6份,每份0.5 g,分別加入熊果酸對(duì)照品4.0mg,7.5 mL 75%的乙醇溶液,浸泡20 min,超聲提取45 min,提取溫度40℃,提取功率500 W。提取兩次,過(guò)濾,合并提取液,按1.3.1項(xiàng)下操作,測(cè)定吸光度值???cè)坪康腞SD為4.27%,表明方法準(zhǔn)確度良好。

    1.3.4 超聲波輔助提取三萜類化合物的單因素實(shí)驗(yàn)

    1.3.4.1 乙醇濃度考察

    精密稱取藥材粉末10.0 g,共5份,分別加入150 mL乙醇溶液,乙醇濃度分別為 15%、35%、55%、75%、95%。浸泡20 min,超聲提取45 min,提取功率為500 W。提取兩次,提取液過(guò)濾,合并濾液,濃縮,水浴鍋蒸干,得到樣品提取物。

    1.3.4.2 料液比考察

    分別精密稱取粉末10.0 g,共5份,分別加入100、150、200、250、300 mL 75% 的乙醇溶液。浸泡20 min,超聲提取45 min,提取功率500 W。提取兩次,提取液過(guò)濾,合并濃縮,水浴鍋蒸干,得到樣品提取物。

    1.3.4.3 提取功率考察

    精密稱取藥材粉末10 g,共5份,分別加入150 mL 75%的乙醇溶液。浸泡20 min,超聲提取45 min,提取功率分別為 120、200、300、400、500 W。提取兩次,提取液過(guò)濾,合并濃縮,水浴鍋蒸干,得到樣品提取物。

    1.3.4.4 提取時(shí)間考察

    精密稱取藥材粉末10 g,共5份,每份分別加入150 mL 75%乙醇溶液。浸泡20 min,分別超聲提取15、30、45、60、75 min,提取功率為 500 W。提取兩次,提取液過(guò)濾,合并濃縮,水浴鍋蒸干,得到樣品提取物。

    1.3.5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波輔助提取三萜類化合物的工藝參數(shù)

    根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定總?cè)频挠绊懸蛩?,分別為乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取功率(D),選取總?cè)频寐瘦^高的三組數(shù)據(jù),運(yùn)用Design-Expert8.05軟件程序根據(jù) Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法,以總?cè)频奶崛〉寐蕿轫憫?yīng)值作響應(yīng)面,對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。因素與水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

    表1 響應(yīng)面分析因素和水平Table 1 Factors and levels of RSA

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲波功率、提取時(shí)間對(duì)三萜類化合物提取率的影響見圖1。

    圖1 料液比(A)、乙醇濃度(B)、超聲功率(C)及提取時(shí)間(D)對(duì)總?cè)铺崛〉挠绊慒ig.1 Effect ofmaterial-solvent ratio(A),ethanol concentration(B),ultrasonic power(C)and extraction time(D)on extraction yield of triterpenoid

    2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化

    2.2.1 響應(yīng)面分析因素水平的選擇

    根據(jù)Box-behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲波功率和提取處理時(shí)間進(jìn)行4因素3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),利用Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合,實(shí)驗(yàn)因素和水平見表1。

    以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、提取時(shí)(C)和間超聲波功率(D)為自變量,三萜類化合物的提取率(Y)為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

    表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and experimental results of RSA

    3 0-1 1 0 9.091 9.594 4 1 0 0-1 11.554 11.727 5 0 0-1 1 11.507 11.261 6 0 0 0 0 10.302 11.369 7 0 0 0 0 11.787 11.369 8 1 1 0 0 12.615 12.196 9 0 1 0 1 12.639 12.728 10 0 0 1 -1 10.43 10.159 11 0 0 1 1 12.46 11.956 12 -1 0 -1 0 7.743 8.005 13 1 0 0 1 12.55 12.809 14 -1 0 1 0 9.381 9.077 15 0 1 1 0 10.17 10.955 16 -1 0 0 -1 8.574 8.779 17 0 0 0 0 11.787 11.369 18 -1 1 0 0 9.767 9.410 19 0 1 -1 0 10.705 10.665 20 -1 -1 0 0 8.295 8.197 21 0 0 0 0 12.535 11.369 22 1 -1 0 0 10.934 10.774 23 0 -1 -1 0 9.713 9.391 24 0 -1 0 -1 10.097 10.062 25 0 0 0 0 10.435 11.369 26 1 0 1 0 11.142 10.933 27 -1 0 0 1 10.103 10.394 28 0 1 0 -1 11.043 10.985 29 0 0 -1 -1 10.374 10.361

    2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

    Design-Expert軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合得到三萜得率對(duì)乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取功率的二次多項(xiàng)回歸模型:

    Y=-10.63+0.35 × A+0.54 × B+0.33 × C-0.02×D+5.225×10-4×A ×B-1.375×10-3×A ×C-6.66×10-5×A ×D+2.9×10-4×B ×C+3.95×10-4×B ×D+1.50×10-4×C ×D-1.87×10-3×A2-0.02×B2-3.29×10-3×C2+3.05×105×D2

    Y為總?cè)坪浚珹、B、C、D分別為乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取功率???cè)坪康念A(yù)測(cè)響應(yīng)值可從二次多項(xiàng)式方程中的自變量值中獲得。對(duì)上述回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見表3。

    表3 總?cè)铺崛÷实姆讲罘治霰鞹able 3 AVONA of extraction of triterpenoid from A.eriantha

    AC 0.680 1 0.681 1.588 0.2283 AD 0.071 1 0.071 0.166 0.6902 BC 0.002 1 0.002 0.004 0.9480 BD 0.156 1 0.156 0.363 0.5565 CD 0.201 1 0.201 0.469 0.5045 A2 3.624 1 3.624 8.453 0.0115 B2 1.478 1 1.478 3.447 0.0845 C2 3.554 1 3.554 8.290 0.0121 D2 0.605 1 0.605 1.411 0.2546 Model 42.292 14 3.021 7.046 0.0004 Residual 6.002 10 0.429 Lack of fit 2.282 4 0.228 0.245 0.9674 Pure error 3.720 28 0.930 Cor total 48.294 R2=0.876 R2 Adj=0.751 CV=6.129 Adeq precision=10.200

    從表3分析可知,該模型 F值等于7.046且“Prob>F”小于0.05說(shuō)明擬合的模型高度顯著。失擬項(xiàng)是模型中數(shù)據(jù)的變異,失擬項(xiàng)的F值和P值分別為0.245和0.967,說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著,該回歸方程無(wú)失擬因素存在,回歸模型與實(shí)測(cè)值能較好的擬合。R2Pre為0.607和 R2Adj為0.751均在合理的范圍內(nèi),信噪比為10.200,表示該模型有足夠的信號(hào)。以上均說(shuō)明該模型可用于優(yōu)化總?cè)铺崛」に囋O(shè)計(jì)。

    2.2.3 響應(yīng)曲面分析

    圖2 乙醇濃度(A)和料液比(B)對(duì)總?cè)铺崛∮绊懙捻憫?yīng)面和等高線圖Fig.2 Response surface plot and contour plot showing the effect of A and B on extraction yield of triterpenoid

    圖3 乙醇濃度(A)和提取時(shí)間(C)對(duì)總?cè)铺崛∮绊懙捻憫?yīng)面和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot showing the effect of A and C on extraction yield of triterpenoid

    圖4 乙醇濃度(A)和提取功率(D)對(duì)總?cè)铺崛∮绊懙捻憫?yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot showing the effect of A and D on extraction yield of triterpenoid

    圖5 料液比(B)和提取時(shí)間(C)對(duì)總?cè)铺崛∮绊懙捻憫?yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot showing the effect of B and C on extraction yield of triterpenoid

    圖6 料液比(B)和提取功率(D)對(duì)總?cè)铺崛∮绊懙捻憫?yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot showing the effect of B and D on extraction yield of triterpenoid

    圖7 提取時(shí)間(C)和超聲功率(D)對(duì)總?cè)铺崛∮绊懙捻憫?yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot showing the effect of C and D on extraction yield of triterpenoid

    根據(jù)回歸方程,做出的響應(yīng)面和等高線圖,是特定的響應(yīng)面Y(總?cè)频奶崛÷?對(duì)應(yīng)的因素A、B、C、D構(gòu)成的一個(gè)三維空間在二維平面上的等高圖,可直觀反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則與之相反。

    2.3 總?cè)频淖顑?yōu)工藝條件與驗(yàn)證

    Design-Expert軟件分析處理,結(jié)果表明,從毛花獼猴桃根中超聲提取總?cè)频淖顑?yōu)條件為:乙醇濃度71.72%,料液比 1∶20(g/mL),提取時(shí)間 45.24 min,提取功率400 W???cè)频暮?3.26 mg/g??紤]到實(shí)際操作條件,將毛花獼猴桃根三萜提取的最佳工藝調(diào)整為:乙醇濃度72%,料液比1∶20(g/mL),提取時(shí)間45 min,提取功率400 W。依據(jù)調(diào)整后的條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),重復(fù)三次,得到總?cè)坪科骄禐?2.65 mg/g,實(shí)際值與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為4.60%,實(shí)際值與理論值非常接近,說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合良好。

    3 討論

    近年來(lái),超聲波輔助提取結(jié)合響應(yīng)面分析法在優(yōu)化黃酮[7]、三萜[8]、皂苷[6]、多糖[9]、多酚[10]等天然有效成分的提取工藝中得到了廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)相比,響應(yīng)面分析法能夠更好地反映多種實(shí)驗(yàn)因素間的交互作用,并在給出的區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的回歸方程,進(jìn)行精確回歸分析,從而優(yōu)選到最佳的考察因素值。

    毛花獼猴桃根中總?cè)频奶崛」に囇芯窟€未見報(bào)道,因此本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助提取的方法結(jié)合響應(yīng)面分析首次對(duì)毛花獼猴桃根中的總?cè)瞥曁崛l件進(jìn)行了優(yōu)化考察,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,乙醇濃度對(duì)總?cè)频某曁崛∮绊憳O其顯著,料液比和超聲功率對(duì)總?cè)铺崛〉挠绊懸卜浅o@著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的回歸模型顯著,失擬誤差不顯著,說(shuō)明通過(guò)本實(shí)驗(yàn)所建立的二次回歸方程能較好的描述各因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系,該模型顯著可靠,較好的優(yōu)化了從毛花獼猴桃根中提取總?cè)频墓に?,得到的最佳提取條件為乙醇濃度72%,料液比1∶20 g/mL,超聲波功率400W,提取時(shí)間45 min。該方法不但操作簡(jiǎn)單,耗時(shí)短,提取效率高,而且在較低溫條件下進(jìn)行,避免了對(duì)提取物有效成分的破壞,因此,可廣泛應(yīng)用于毛花獼猴桃根中總?cè)频奶崛 ?/p>

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