甘草黃酮對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟中GSK-3β蛋白表達(dá)的影響

金 鑫，趙海燕，馬永平

北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川750021

糖原合成酶激酶-3(Glycogen synthase kinase-3，GSK-3)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。該激酶的兩種異構(gòu)體GSK-3α和GSK-3β均在人類的外周胰島素敏感組織中表達(dá)。在靜息細(xì)胞中，GSK-3是有活性的，可使糖原合成酶(Glycogen synthase，GS)的絲氨酸位點(diǎn)磷酸化，從而抑制GS的活性，減少糖原合成;而胰島素可間接抑制GSK-3的活性，使GS去磷酸化，從而激活 GS，促進(jìn)糖原合成。研究表明，GSK-3的活性增強(qiáng)或異常高表達(dá)可導(dǎo)致嚙齒動(dòng)物和人類的胰島素抵抗［1，2］。在嚙齒動(dòng)物肥胖和2型糖尿病(T2DM)模型中，GSK-3抑制劑通過(guò)增加糖原合成、抑制肝臟糖異生而減少葡萄糖輸出，從而增強(qiáng)胰島素敏感性并改善血糖水平［3］。因此，GSK-3被認(rèn)為是治療2型糖尿病新的藥物靶點(diǎn)。

已有研究表明，甘草黃酮(LF)可抑制KK-Ay小鼠的血糖升高和腹部脂肪積累;它對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖C57BL/6J小鼠的腹部脂肪積累和體重增加有明顯的抑制作用，同時(shí)可降低血清胰島素和瘦素的含量;LF還可顯著降低高膽固醇患者的甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)，并減少LDL-C的氧化。本實(shí)驗(yàn)室前期研究成果顯示，LF能有效預(yù)防大鼠實(shí)驗(yàn)性糖尿病的發(fā)生，并可降低糖尿病大鼠的血糖、抑制其脂代謝紊亂、改善胰島素抵抗［4］;本研究采用 Western blotting方法檢測(cè)LF對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟中GSK3β表達(dá)量的影響，旨在探索LF改善胰島素抵抗的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料

清潔級(jí)雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(40只)由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［合格證號(hào):SCXK(寧)2011-0001］提供，體重180～220 g。飼養(yǎng)于通風(fēng)良好，相對(duì)濕度為50% ～70%，室溫18～22℃環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水，12 h光照周期。普通飼料(標(biāo)粉25%，玉米粉30%，豆粉10%，麩皮20%，魚(yú)粉10%，酵母粉2%，食鹽1%，魚(yú)肝油1%，維生素添加劑0．5%，微量元素添加劑0．5%)與高脂高糖飼料(普通飼料61%，豬油10%，蔗糖20%，蛋黃粉8%，膽酸鈉1%)均由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

1．2 試劑

甘草黃酮系以乙醇為提取劑從甘草(Glycyrrhiza uralensis Fischer)根中提取，并經(jīng)柱層析進(jìn)行純化;鹽酸吡格列酮片購(gòu)自杭州中美華東制藥有限公司;鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自Sigma公司;碘［125I］胰島素(INS)放射免疫分析試劑盒購(gòu)自北京科美東雅生物技術(shù)有限公司;全蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;BCA protein assay kit購(gòu)自Thermo Scientific公司;兔抗大鼠GSK-3β抗體、GAPDH抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。其它試劑均為分析純。

1．3 主要儀器

ONE TOUCH血糖儀由強(qiáng)生(中國(guó))醫(yī)療器材有限公司生產(chǎn);DU-800核酸蛋白檢測(cè)儀由Bec km an公司生產(chǎn);Calibrated Densitometer(GS-800)由Bio-Rad公司生產(chǎn)。

1．4 動(dòng)物分組與處理

采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)結(jié)合一次性小劑量腹腔注射STZ的方法建立2型糖尿病(T2DM)實(shí)驗(yàn)大鼠模型［5］。選30只實(shí)驗(yàn)大鼠以高脂高糖飼料喂養(yǎng)6周，空腹12 h，以35 mg/kg的劑量一次性腹腔注射1%STZ(溶解于0．1 mol/L檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，pH 4．2)。72 h后尾靜脈采血檢測(cè)大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，穩(wěn)定在 16．7 mmol/L以上為造模成功。將成模大鼠(27只)隨機(jī)分為糖尿病模型組(DM，9只)、甘草黃酮組(LF，9只)和陽(yáng)性對(duì)照組(PC，9只)，繼續(xù)以高脂高糖飼料喂養(yǎng)，同時(shí)每天分別以溶劑(1，2-丙二醇)、甘草黃酮［300 mg/(kg·d)］和吡格列酮［10 mg/(kg·d)］灌胃。每周稱一次體重，根據(jù)體重變化及時(shí)調(diào)整給藥量［給藥量(mg)=體重(kg)×甘草黃酮或吡格列酮給藥劑量］，持續(xù)6周(灌胃過(guò)程中LF組和PC組各有1只大鼠死亡)。另選同批大鼠10只作為正常對(duì)照組(CON)，以普通飼料喂養(yǎng)，并以溶劑灌胃。

1．5 取樣

實(shí)驗(yàn)大鼠于處死前空腹12 h，禁食不禁水，10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后迅速將其胸腔打開(kāi)，心臟取血并分離血清。取部分肝臟用錫箔紙包裹后置于液氮中速凍，-80℃冰箱保存，備用。

1．6 空腹血糖和胰島素檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)大鼠于處死前空腹12 h，禁食不禁水，尾靜脈采血，檢測(cè)各組大鼠FBG。放射免疫法測(cè)定空腹血清胰島素(FINS)含量，具體操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。根據(jù)FBG和FINS的測(cè)定結(jié)果，計(jì)算ISI。

ISI=Ln(FBG×FINS)-1

1．7 免疫印跡法(Western-blotting)分析

1．7．1 肝臟總蛋白提取與定量

采用全蛋白提取試劑盒提取肝臟總蛋白，BCA protein assay kit制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，在562 nm下用DU-800測(cè)定各樣品吸光值，計(jì)算各樣品的蛋白含量。

1．7．2 Western-blotting

精確量取相當(dāng)于30μg蛋白質(zhì)的樣品液，與2×上樣緩沖液等體積混合，100℃變性處理3～5 min;SDS-PAGE(7．5%分離膠和5%濃縮膠)分離蛋白質(zhì)。分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。根據(jù)預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的位置，將目的蛋白分子量范圍的膜切下，以3%BSA室溫封閉1．5 h。每條膜分別以封閉液配制的兔抗大鼠GSK-3β抗體或GAPDH抗體4℃孵育過(guò)夜。PBS-Tween-20洗膜3次，每次10min。加入封閉液配制的二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的)，室溫孵育1 h。采用ECL試劑盒顯色并用X射線膠片感光。

1．7．3 圖像掃描及分析

采用Calibrated Densitometer(Bio-RAD，GS800)對(duì)膠片進(jìn)行掃描，用Quality One軟件對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行定量。蛋白相對(duì)表達(dá)量用(靶蛋白/GAPDH/Standard)的OD值表示。注:1)GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的英文縮寫(xiě)，作為內(nèi)部參照(Internal Control)。該蛋白是由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins)，其在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在Western Blotting實(shí)驗(yàn)中常用來(lái)做參照物，以校正上樣過(guò)程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性;2)Standard為內(nèi)標(biāo)，是某只大鼠肝臟的蛋白提取樣品，每塊膠板上都采用相同的內(nèi)標(biāo)，以校正不同膠板之間的誤差。

1．8 數(shù)據(jù)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1 LF對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠空腹血糖、胰島素及胰島素敏感指數(shù)的影響

LF對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血糖、胰島素及胰島素敏感指數(shù)的影響如表1所示。與CON組相比，DM組大鼠的FBG顯著升高(P＜0．01)、ISI顯著下降(P＜0.01)。與DM組相比，LF組和PC組大鼠的FBG顯著降低(P ＜0．01)，ISI顯著升高(P ＜0．01)。各組FINS無(wú)顯著差異。

表1 LF對(duì)空腹血糖、胰島素和胰島素敏感指數(shù)的影響(x±s)Table 1 Effects of LF on levels of FBS，F(xiàn)INS and ISI±s)

表1 LF對(duì)空腹血糖、胰島素和胰島素敏感指數(shù)的影響(x±s)Table 1 Effects of LF on levels of FBS，F(xiàn)INS and ISI±s)

注:* 與 CON組相比，P ＜0．01;△與DM 組相比，P ＜0．01。Note:*compare with CON，P ＜0．01;△ compare with DM，P ＜0．01．

胰島素敏感指數(shù)CON 10 4．54 ±0．55 24．22 ±5．97 －4．67 ±0．30糖尿病模型組 DM 9 22．66 ±4．25* 25．26 ±9．97 －6．22 ±0．51*甘草黃酮組 LF 8 6．17±1．56△ 20．97±8．01 －4．70±0．49△陽(yáng)性對(duì)照組 PC 8 6．09±2．35△ 21．61±10．62 －4．66±0．30 ISI正常對(duì)照組組別Group例數(shù)n空腹血糖FBG(mmol/L)空腹胰島素FINS(m IU/L)△

2．2 LF對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟組織GSK-3β蛋白表達(dá)量的影響

采用Western-blotting方法對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟組織中GSK-3β的蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，代表性免疫印跡圖如圖1所示。與CON組相比，DM組大鼠肝臟組織中GSK-3β的蛋白表達(dá)量顯著升高了86．67%(P＜0．01)。與DM組相比，LF組和PC組大鼠肝臟組織中 GSK-3β的蛋白表達(dá)量分別降低了44.64%(P ＜0．05)和 55．36%(P ＜0．05);LF 組與PC組的蛋白表達(dá)量沒(méi)有顯著差異。

圖1 肝臟組織中GSK-3β蛋白的免疫印跡圖譜Fig.1 Immunoblot of GSK-3βprotein in liver

圖2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟組織中GSK-3β蛋白表達(dá)情況±s)Fig.2 The expression of GSK-3β protein in rats’liver of different groupss)

3 討論

本研究采用Western Blotting方法，定量分析了甘草黃酮對(duì)糖尿病大鼠肝臟組織中GSK-3β蛋白表達(dá)的影響。研究結(jié)果表明，LF可顯著降低糖尿病大鼠肝臟組織中GSK-3β蛋白的表達(dá)量，這是首例關(guān)于LF影響胰島素信號(hào)分子蛋白表達(dá)的報(bào)道。

胰島素對(duì)葡萄糖利用的促進(jìn)作用包括刺激葡萄糖向其靶細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和增強(qiáng)糖原合成兩個(gè)生理過(guò)程，這兩個(gè)過(guò)程均是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果。胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙，均會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗，進(jìn)而導(dǎo)致T2DM的發(fā)生與發(fā)展。GSK-3β在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著負(fù)調(diào)節(jié)作用，其活性增強(qiáng)或異常高表達(dá)可導(dǎo)致嚙齒動(dòng)物和人類的胰島素抵抗［1，2］。研究表明［6，7］，肌肉中胰島素調(diào)節(jié)葡萄糖利用的主要環(huán)節(jié)是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn);而在肝臟中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)不是限速步驟。GSK-3抑制劑 CHIR98023和CHIR99021可顯著提高Zucker糖尿病肥胖(fa/fa)大鼠對(duì)葡萄糖的利用，主要是通過(guò)增強(qiáng)胰島素刺激的肝臟組織的糖原合成，而對(duì)肌肉組織的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖原合成無(wú)影響［8］。上述結(jié)果提示，肝臟中GSK-3的抑制是促進(jìn)機(jī)體對(duì)葡萄糖的利用和改善胰島素抵抗的主要靶點(diǎn)。本研究中LF顯著降低了DM組大鼠肝臟組織中GSK-3β蛋白的表達(dá)量，表明LF可能通過(guò)下調(diào)GSK-3β的表達(dá)增強(qiáng)肝臟組織的糖原合成，從而改善糖尿病大鼠的胰島素抵抗。

許多用于治療糖尿病的胰島素增敏劑，如噻唑烷二酮(thiazolidinedione，TZD)類中的 troglitazone(曲格列酮)、pioglitazone(匹格列酮)和rosiglitazone(羅格列酮)都是PPAR-γ的激活劑［9］。已有研究證實(shí)，某些甘草黃酮組分具有 PPAR-γ配體結(jié)合活性［10］，提示這些組分可能是 TZD藥物的結(jié)構(gòu)類似物。本研究采用吡格列酮作為陽(yáng)性對(duì)照，它對(duì)GSK-3β蛋白表達(dá)的下調(diào)程度與LF的作用相當(dāng)，提示LF與吡格列酮對(duì)該蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用類似。

綜上所述，甘草黃酮能顯著降低2型糖尿病大鼠肝臟中GSK-3β的蛋白表達(dá)量，這可能是其改善胰島素抵抗的分子機(jī)制之一。

1 Eldar-Finkelman H，Schreyer SA，Shinohara MM，et al．Increased glycogen synthase kinase-3 activity in diabetes-and obesity-prone C57BL/6Jmice．Diabetes，1999，48:1662-1666．

2 Nikoulina SE，Ciaraldi TP，Mudaliar S，et al．Potential role of glycogen synthase kinase-3 in skeletalmuscle insulin resistance of type 2 diabetes．Diabetes，2000，49:263-271．

3 Ring DB，Johnson KW，Henriksen EJ，et al．Selective glycogen synthase kinase 3 inhibitors potentiate insulin activation of glucose transportand utilization in vitro and in vivo．Diabetes，2003，52:588-595．

4 Zhao HY(趙海燕)，Wang Y(王勇)，Ma YP(馬永平)，et al．Suppressive effect of licorice flavonoids on hyperglycemia and hyperlipidemia in type 2 diabetic rats．China JMod Med(中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志)，2010，20:2573-2578．

5 Yang Y(楊雁)，Hu SH(胡蜀紅)，Zhang JH(張建華)，et al．Alzheimer-like hyperphosphorylation of Tau in brains of rats with obesity and type 2 diabetes．Prog Biochem Biophys(生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展)，2006，33:456-464．

6 Rothman DL，Shulman RG，Shulman GI．31P nuclearmagnetic resonance measurements of muscle glucose-6-phosphate:evidence for reduced insulin-dependentmuscle glucose transport or phosphorylation activity in non-insulin-dependent diabetesmellitus．JClin Invest，1992，89:1069-1075．

7 Cline GW，Petersen KF，Krssak M，et al．Impaired glucose transport as a cause of decreased insulin-stimulated muscle glycogen synthesis in type 2 diabetes．N Engl JMed，1999，341:240-246．

8 Cline GW，Johnson K，Regittnig W，et al．Effects of a novel glycogen synthase kinase-3 inhibitor on insulin-stimulated glucosemetabolism in Zucker diabetic fatty(fa/fa)rats．Diabetes，2002，51:2903-2910．

9 Kaplan F，Al-Majali K，Betteridge DJ．PPARS，insulin resistance and type 2 diabetes．J Cardiovasc Risk，2001，8:211-217．

10 Mae T，Kishida H，Nishiyama T，et al．A licorice ethanolic extract with peroxisome proliferator-activated receptor-γligand-binding activity affects diabetes in KK-Aymice，abdominal obesity in diet-induced obese C57BLmice and hypertension in spontaneously hypertensive rats．Nutrition，2003，133:3369-3377．