鞘內(nèi)預(yù)注右美托咪啶對(duì)脊髓缺血／再灌注損傷后脊髓水含量、小膠質(zhì)細(xì)胞及基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響

王 赫，李曉倩，馬 虹

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，遼寧沈陽(yáng) 110001）

既往研究發(fā)現(xiàn)，坐骨神經(jīng)結(jié)扎前鞘內(nèi)預(yù)注右美托咪啶（dexmedetomidine，DEX）能夠有效減輕神經(jīng)病理性疼痛，減少脊髓組織中炎性因子的產(chǎn)生，改善預(yù)后［1］。一些研究表明，脊髓缺血／再灌注損傷（spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI）后，減輕脊髓水腫、維持血脊髓屏障（blood spinal cord barrier，BSCB）的完整性，可以減少SCIRI所致的神經(jīng)損傷［2］。鞘內(nèi)預(yù)注DEX是否通過(guò)抑制SCIRI后小膠質(zhì)細(xì)胞變化和基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)對(duì)脊髓水腫產(chǎn)生作用，有待深入研究。本研究采用阻斷胸主動(dòng)脈血流合并系統(tǒng)低血壓建立SCIRI模型，探討鞘內(nèi)預(yù)注DEX對(duì)SCIRI后急性脊髓水腫、小膠質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases，MMP-9）變化的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ♂ Sprague-Dawley大鼠295只，體質(zhì)量260～280 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥品和儀器 伊文思藍(lán)（evans blue，Sigma）；兔抗MMP-9多克隆抗體（Santa Cruz）；兔抗 Iba-1單克隆抗體（Wako）；共聚焦熒光顯微鏡；GLS-700D型數(shù)碼凝膠掃描分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 大鼠隨機(jī)分為4組。非假手術(shù)組參照文獻(xiàn)［3］制備SCIRI模型，并行 L5-L6鞘內(nèi)置管。假手術(shù)組（Sham組）：胸主動(dòng)脈血流阻斷前2 d鞘內(nèi)注射生理鹽水30 μl，開胸并暴露胸主動(dòng)脈而不阻斷；SCIRI組（IR組，鞘內(nèi)注射30μl生理鹽水）：胸主動(dòng)脈血流阻斷前2 d鞘內(nèi)注射生理鹽水30μl，暴露胸主動(dòng)脈并于左鎖骨上動(dòng)脈之間無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉14 min；DEX組（鞘內(nèi)注射右美托咪啶）：胸主動(dòng)脈血流阻斷前2 d鞘內(nèi)注射右美托咪啶10、30μl，暴露胸主動(dòng)脈并于左鎖骨上動(dòng)脈之間無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉14 min；D+A組（鞘內(nèi)注射右美托咪啶及其抑制劑阿替美唑）：胸主動(dòng)脈血流阻斷前2 d鞘內(nèi)注射右美托咪啶10μg+阿替美唑10μg（共30μl），暴露胸主動(dòng)脈并于左鎖骨上動(dòng)脈之間無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉14min。腹腔注射0.3ml氨芐青霉素（0.1 g·L-1）。術(shù)后單籠飼養(yǎng)。

2.2 脊髓水腫測(cè)定 采用干濕法測(cè)定脊髓含水量，評(píng)價(jià)脊髓水腫。

2.3 伊文思藍(lán)測(cè)定血-脊髓屏障完整性 血脊髓屏障通透性測(cè)定經(jīng)耳緣靜脈緩慢勻速注射質(zhì)量濃度為20 g·L-1的伊文思藍(lán)45 mg·kg-1。取出脊髓缺血節(jié)段（L4-L6），離心，取上清液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)（λ＝632 nm）OD值，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每克脊髓組織中EB含量（μg·g-1）。

2．4 小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1與MMP-9熒光雙標(biāo)染色

取MMP-9和Iba-1二者都為陽(yáng)性作為表達(dá)MMP-9的小膠質(zhì)細(xì)胞，每個(gè)截面（蒙太奇拼接成整個(gè)冠狀面圖）的陽(yáng)性細(xì)胞用Image Pro P1us6.0軟件計(jì)數(shù)3個(gè)冠狀平面的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的平均值和平均光密度值（mean optical density，MOD）。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)結(jié)果以s表示。數(shù)據(jù)處理采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用單因素方差分析（ANOVA）比較組間差異，使用post hoc schaffe tests進(jìn)行多重比較。

3 結(jié)果

3.1 脊髓含水量 與Sham相比，IR組SCIRI后脊髓水含量48h達(dá)到最高峰，明顯大于12和24 h，48～72 h脊髓水腫無(wú)明顯變化，自d 5開始脊髓含水量下降，7 d水腫小于5 d（F＝11．03，P＜0.05）；與 IR組相比，DEX組各時(shí)點(diǎn)脊髓含水量均明顯下降（F＝12.73，P＜0.05，Tab 1）。

3．2 脊髓組織中EB含量 與Sham相比，IR組SCIRI后脊髓組織中EB含量48 h達(dá)到最高峰，明顯大于12和24 h，48～72 h脊髓水腫無(wú)明顯變化，自d 5開始脊髓組織中EB含量下降，7 d EB滲出小于5 d（F＝11．93，P＜0.05）；與 IR組相比，DEX組各時(shí)點(diǎn)脊髓組織中EB滲出均明顯下降（F＝13．13，P＜0.05，Tab 2）。

Tab 1 Spinal water content in each key point time after SCIRI（%，n＝6）

Tab 2 Spinal Evans blue content in each key point time after SCIRI（μg·g-1，n＝4）

Tab 3 Cell numbers of double positive labeled w ith MMP-9／Iba-1 in each key point time after SCIRI（numbers／mm2，n＝6）

3．3 SCIRI后小膠質(zhì)細(xì)胞（Iba-1）與金屬基質(zhì)蛋白酶（MMP-9）熒光雙標(biāo)染色 與Sham相比，IR組再灌注損傷后，脊髓背角Iba-1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞開始逐漸增多，于48 h達(dá)到最高峰，明顯大于12和24 h，自d 5開始Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量下降，d 7陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量小于 d 5（F＝14．65，P＜0.05）；與IR組相比，DEX組各時(shí)點(diǎn)Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量均明顯減少（F＝12．34，P＜0.05）。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)分析示SCIRI后表達(dá)MMP-9的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目在12～36 h之間開始增加，在48 h時(shí)達(dá)到高峰，5 d時(shí)已經(jīng)明顯下降（Tab 3）。

4 討論

SCIRI后血 -脊髓屏障（blood-spinal cord barrier，BSCB）完整性破壞，通透性增加，造成脊髓組織水腫、炎癥反應(yīng)。缺血前鞘內(nèi)注射DEX可以提高再灌注損傷后BSCB的完整性，減輕脊髓損傷區(qū)域的水腫程度，且上述DEX的抗脊髓水腫的機(jī)制涉及α2AR的激動(dòng)，與既往Bell MT等的研究結(jié)果一致。

通常正常大鼠脊髓中有少量小膠質(zhì)細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)SCIRI后損傷的脊髓組織中開始出現(xiàn)呈巨噬細(xì)胞樣的激活狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞，并逐漸增多，加入DEX后在陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，說(shuō)明DEX可抑制SCIRI后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，是其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的重要因素之一。其保護(hù)作用可能通過(guò)提高小膠質(zhì)細(xì)內(nèi)的環(huán)磷腺苷水平［4］，調(diào)節(jié)組織間隙Na+，K+，Ca2+離子穩(wěn)態(tài)以及谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放的平衡［5］，以及選擇性抑制p38MAPK信號(hào)通路中的p38β亞型而特異性阻斷脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的活化［6］。

我們既往研究發(fā)現(xiàn)，SCIRI后MMP-9表達(dá)表達(dá)增加，與脊髓水腫有密切聯(lián)系。在本研究中，發(fā)現(xiàn)DEX能夠通過(guò)抑制SCIRI后小膠質(zhì)細(xì)胞活化，下調(diào)MMP-9蛋白表達(dá)從而減輕脊髓損傷部位水腫、減輕脊髓缺血／再灌注損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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