吉非替尼通過增加Foxo3a活性抑制肺纖維化小鼠上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化*

彭 婷， 杜海堅， 李 理， 李偉峰△， 黃文杰

(1南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東廣州 510515;2廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東廣州 510010)

吉非替尼通過增加Foxo3a活性抑制肺纖維化小鼠上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化*

彭 婷1，2， 杜海堅2， 李 理2， 李偉峰2△， 黃文杰2

(1南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東廣州 510515;2廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東廣州 510010)

目的：研究吉非替尼對肺纖維化小鼠轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O3a(Foxo3a)活性、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)水平及相關(guān)通路的影響，探討吉非替尼抑制肺上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的可能機(jī)制。方法：將30只SPF級雌性昆明小鼠隨機(jī)分為3組:對照組(生理鹽水氣管內(nèi)霧化)、博來霉素組(博來霉素3 mg/kg溶于100 μL生理鹽水氣管內(nèi)霧化)和吉非替尼處理組(博來霉素氣管內(nèi)霧化后，每天吉非替尼20 mg/kg溶于100 μL生理鹽水灌胃)。實(shí)驗(yàn)第14天收集樣本，將小鼠肺組織置于10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片后行HE與Masson染色;RT-PCR法檢測Foxo3a和α-SMA mRNA表達(dá)水平;Western blotting法檢測表皮生長因子受體(EGFR)、Akt、Foxo3a和α-SMA蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：吉非替尼處理組小鼠肺組織病理損傷較博來霉素組明顯減輕，膠原沉積明顯減少，炎癥損傷評分及纖維化評分明顯下降(均P＜0.01)，F(xiàn)oxo3a mRNA表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，α-SMA mRNA表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)，總Foxo3a蛋白表達(dá)增加，但Foxo3a磷酸化水平顯著下降(P＜0.01)，胞核Foxo3a蛋白明顯增加(P＜0.05);同時，EGFR和Akt磷酸化水平也顯著下降(P＜0.01，P＜0.05)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論：吉非替尼抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化，其機(jī)制可能與抑制EGFR/Akt通路活化、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子Foxo3a活性、從而抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化密切相關(guān)。

吉非替尼;叉頭框蛋白O3a;肺纖維化;博來霉素;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)重要的特征改變，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)及其受體(EGF receptor，EGFR)在間質(zhì)性肺疾病發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用［1］，是參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的重要因素［2-3］。前期本實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)吉非替尼(gefitinib，Ge)能緩解博來霉素(bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，同時下調(diào)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化重要標(biāo)志——α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，但具體通路及機(jī)制尚未闡明［4-5］。

近年研究表明，叉頭框蛋白(forkhead box protein，F(xiàn)OX)家族是調(diào)控上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的重要轉(zhuǎn)錄因子［6］，其重要成員叉頭框蛋白O3a(forkhead box protein O3a，F(xiàn)oxo3a)參與纖維化的發(fā)生發(fā)展［7-8］，而 EGFR/Akt通路可直接調(diào)節(jié) Foxo3a活性［9］。于是，本研究建立博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型，觀察吉非替尼對EGFR/Akt通路、轉(zhuǎn)錄因子Foxo3a活性及α-SMA表達(dá)水平的影響，探討吉非替尼抑制肺纖維化中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的可能機(jī)制。

材料和方法

1 動物

8周齡SPF級雌性昆明小鼠共30只，體重約28 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。所有操作和實(shí)驗(yàn)流程均遵守《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》。

2 主要試劑

博來霉素購自浙江海正藥業(yè)，吉非替尼購自美國阿斯利康公司;Masson染色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司;PrimeScript RT Master Mix購自寶生物工程有限公司，2×Taq Master Mix購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;Foxo3a抗體購自江蘇碧云天公司，EGFR抗體、p-EGFR抗體、Akt抗體、p-Akt抗體和p-Foxo3a抗體均購自CST，α-SMA抗體和β-actin抗體購自武漢博士德公司，H2A抗體購自SAB;小鼠喉鏡、小鼠固定操作臺與MicroSprayerTM霧化器來自Penn-Century。所用引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計合成。

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計 30只小鼠隨機(jī)分為對照組、BLM組和吉非替尼處理(BLM+Ge)組，每組10只。BLM組小鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后固定于操作臺，以動物喉鏡壓下小鼠舌根暴露聲門，將霧化器從聲門插入氣管霧化博來霉素溶液(3 mg/kg，100 μL)，對照組霧化等體積生理鹽水;BLM+Ge組小鼠霧化BLM后每天給予吉非替尼(20 mg/kg，100 μL)灌胃，對照組與BLM組予相同體積生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)第14天收集標(biāo)本待測。

3.2 肺組織病理改變 小鼠肺組織以10%中性甲醛固定后，石蠟包埋切片，HE染色及Masson膠原染色，膠原染色操作嚴(yán)格按照Masson染色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)公司)產(chǎn)品說明書進(jìn)行。肺損傷程度評分參照Mikawa等［10］的方法、纖維化程度評分參照Ashcroft等［11］的方法進(jìn)行。

3.3 RT-PCR檢測肺組織Foxo3a與α-SMA mRNA表達(dá) 按RNAiso Plus試劑盒說明書提取各組小鼠肺組織總RNA，紫外分光光度計定量后稀釋成同一濃度(500 mg/L)，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。引物序列為: Foxo3a上游引物5’-CGGACAAACGGCTCACTTT-3’，下游引物5’-TCGGCTCTTGGTGTACTTG-3’;α-SMA上游引物5＇-ACCCAGATTATGTTTGAGACC-3’，下游引物5’-CCGTCAGGCAGTTCGTAG-3’;β-actin上游引物5’-AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3’，下游引物5’-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3’。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃ 40 s，55℃40 s，72℃ 40 s，72℃ 10 min。以β-actin為基準(zhǔn)進(jìn)行相對定量。

3.4 Western blotting檢測肺組織EGFR、Akt、Foxo3a和α-SMA 分別提取各組小鼠肺組織總蛋白及胞漿、胞核蛋白，BCA法蛋白定量后，每份蛋白樣品取50 μg上樣進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉20 mL室溫封閉1.5 h。TBST洗膜后，總蛋白樣本分別加入 EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、Foxo3a、p-Foxo3a、α-SMA和β-actin抗體，胞核蛋白樣本加入Foxo3a抗體和H2A抗體，4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記的Ⅱ抗37℃孵育1 h。TBST洗膜后，ECL發(fā)光試劑檢測蛋白印跡條帶，吸光度掃描儀掃描膠片，Gelpro32軟件分析結(jié)果。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，肺組織病理評分用Kruskal-Walis檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 肺組織病理改變

1.1 小鼠肺臟HE染色 對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁薄，無明顯充血及細(xì)胞浸潤，見圖1A;BLM組小鼠肺組織大面積實(shí)變，肺泡間隔增厚，間隔內(nèi)成纖維細(xì)胞增多，肺泡內(nèi)出血，炎癥細(xì)胞浸潤，見圖1B; BLM+Ge組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)相對完整，少量炎癥細(xì)胞浸潤，見圖1C。BLM和BLM+Ge組小鼠肺組織病理評分分別為8.42±1.68和5.44±1.33，BLM+Ge組小鼠肺組織病理評分較BLM組降低，兩者均高于對照組(1.10±0.80)，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(n= 5，P＜0.01)。

Figure 1.Pathological changes of lung tissue(HE staining，×200).A:control;B:bleomycin;C:bleomycin plus gefitinib.圖1 小鼠肺組織HE染色

1.2 小鼠肺臟Masson染色及纖維化病理評分 對照組肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤、膠原沉積，見圖2A;BLM組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)可見滲出、炎癥細(xì)胞浸潤和大量藍(lán)色膠原沉積，見圖2B;BLM+Ge組小鼠氣道上皮下出現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔稍增厚，但結(jié)構(gòu)基本完整，少量藍(lán)色膠原沉積，見圖2C。3組小鼠肺組織纖維化病理評分依次為1.46±0.88、8.44±1.80和5.54± 1.32。BLM組評分較對照組顯著增加(n=5，P＜0.01)，BLM+Ge組評分較對照組增加，但比BLM組降低(n=5，P＜0.01)。

Figure 2.Pathological changes of lung tissue(Masson staining，×200).A:control;B:bleomycin;C:bleomycin plus gefitinib.圖2 小鼠肺組織Masson染色

2 肺組織Foxo3a與α-SMA mRNA的表達(dá)水平

BLM組小鼠肺組織Foxo3a mRNA轉(zhuǎn)錄水平較對照組降低(P＜0.01);BLM+Ge組小鼠肺組織Foxo3a mRNA轉(zhuǎn)錄水平較纖維化組增加(P＜0.05)，見圖3。而BLM組小鼠肺組織α-SMA mRNA轉(zhuǎn)錄水平較對照組增加(P＜0.05);BLM+Ge組小鼠肺組織α-SMA mRNA轉(zhuǎn)錄水平較纖維化組降低(P＜0.05)，見圖4。

Figure 3.The RT-PCR analysis for Foxo3a mRNA expression in the lung.A:control;B:bleomycin;C:bleomycin plus gefitinib.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs A;#P＜0.05 vs B.圖3 Foxo3a RT-PCR結(jié)果

Figure 4.The RT-PCR analysis for α-SMA mRNA expression in the lung.A:control;B:bleomycin;C:bleomycin plus gefitinib.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs A;#P＜0.05 vs B.圖4 α-SMA RT-PCR結(jié)果

3 肺組織EGFR、Akt、Foxo3a與α-SMA蛋白的表達(dá)水平

BLM組小鼠肺組織p-EGFR、p-Akt和p-Foxo3a明顯增加(均P＜0.01);BLM+Ge組小鼠肺組織p-EGFR、p-Akt和p-Foxo3a降低(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01)，見圖 5。BLM 組小鼠肺組織總蛋白Foxo3a表達(dá)水平較對照組及吉非替尼組降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖5。BLM組小鼠肺組織胞核Foxo3a明顯降低，α-SMA明顯增加(均P＜0.01);BLM+Ge組小鼠肺組織胞核Foxo3a明顯增高，α-SMA明顯降低(均P＜0.05)，見圖6。

Figure 5.Western blotting for total and phosphorylated protein expression of EGFR，Akt and Foxo3a in the lung.A: control;B:bleomycin;C:bleomycin plus gefitinib.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs A;#P＜0.05，##P＜0.01 vs B.圖5 Western blotting檢測磷酸化EGFR、Akt和Foxo3a蛋白的表達(dá)

討論

Figure 6.Western blotting for nuclear Foxo3a and total α-SMA protein in the lung.A:control;B:bleomycin;C: bleomycin plus gefitinib.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs A;#P＜0.05 vs B.圖6 Western blotting檢測肺組織胞核Foxo3a及α-SMA蛋白的表達(dá)

目前研究認(rèn)為上皮細(xì)胞損傷后的修復(fù)失調(diào)是肺間質(zhì)纖維化關(guān)鍵的病理改變［12-13］，且EGFR參與了上述過程［2-3］。EGFR信號不僅促進(jìn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞分化，而且延長已轉(zhuǎn)分化的間充質(zhì)細(xì)胞壽命，最終加劇纖維化程度［14］。前期本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)使用吉非替尼對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠灌胃后，肺組織EGFR活性顯著降低，EMT標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)減少，小鼠肺部纖維化病理改變明顯減輕，Masson染色示氣道下膠原沉積明顯減少［4-5］，提示抑制EGFR活性能夠減輕博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化與下調(diào)EMT過程密切相關(guān)。

近年有研究表明FOX家族可參與纖維化EMT的相關(guān)基因調(diào)控［6］。FOX蛋白家族是一類DNA結(jié)合區(qū)具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，與機(jī)體發(fā)育、細(xì)胞免疫、物質(zhì)代謝及癌癥發(fā)生相關(guān)。FOXO是FOX家族的一個亞群，具有磷酸化、泛素化、乙?；榷喾N修飾方式，其中最主要的修飾方式為磷酸化和去磷酸化。胞核FOXO蛋白去磷酸化為活性形式，磷酸化的FOXO蛋白則失去活性，由胞核轉(zhuǎn)移至胞漿［15］。本研究發(fā)現(xiàn)吉非替尼干預(yù)后，博來霉素致肺纖維化小鼠轉(zhuǎn)錄因子Foxo3a mRNA表達(dá)水平增加，胞核Foxo3a蛋白表達(dá)增加，相應(yīng)的磷酸化Foxo3a水平降低，提示吉非替尼可抑制胞漿p-Foxo3a，促進(jìn)Foxo3a核轉(zhuǎn)位，上調(diào)胞核Foxo3a表達(dá)水平。同時我們還研究發(fā)現(xiàn)，吉非替尼干預(yù)后，EGFR和Akt磷酸化水平降低，說明吉非替尼使Foxo3a去磷酸化并入核，可能與抑制EGFR/Akt通路活化密切相關(guān)，此與Ganesan等［9］通過EGFR-TKI增加胞核Foxo3a活性致相關(guān)細(xì)胞因子IL-8表達(dá)降低的研究結(jié)果一致。

最近有研究表明Foxo3a失活能夠促進(jìn)特發(fā)性肺纖維化患者成纖維細(xì)胞增殖，同時伴隨膠原聚合物的增加［7］，且Foxo3a在轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用［8］。本研究發(fā)現(xiàn)吉非替尼干預(yù)后纖維化程度明顯減輕，且代表上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵指標(biāo)α-SMA表達(dá)明顯減少，與肺組織細(xì)胞核中Foxo3a的活性變化相反，提示Foxo3a對肺纖維化上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化起負(fù)調(diào)控作用。負(fù)調(diào)控機(jī)制在EMT中普遍存在，能夠降低EMT相關(guān)基因表達(dá)以維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，EGFR-TKI代表藥物吉非替尼通過中斷EGFR信號，下調(diào)EGFR/Akt通路活性，使Foxo3a進(jìn)入細(xì)胞核，降低上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物α-SMA表達(dá)，提示Foxo3a由EGFR/Akt通路調(diào)節(jié)，在肺纖維化上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程中起負(fù)調(diào)控作用。

［1］Rho JK，Choi YJ，Lee JK，et al.Epithelial to mesenchymal transition derived from repeated exposure to gefitinib determines the sensitivity to EGFR inhibitors in A549，a non-small cell lung cancer cell line［J］.Lung Cancer，2009，63(2):219-226.

［2］Chan HW，Smith NJ，Hannan RD，et al.Tackling the EGFR in pathological tissue remodeling［J］.Pulm Pharmacol Ther，2006，19(1):74-78.

［3］Francois H，Placier S，F(xiàn)lamant M，et al.Prevention of renal vascular and glomerular fibrosis by epidermal growth factor receptor inhibition［J］.FASEB J，2004，18(7): 926-928.

［4］李偉峰，李 理，袁偉鋒，等.吉非替尼抑制博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化［J］.中國病理生理雜志，2010，26(8):1565-1569.

［5］李 理，李偉峰，蔡 琳，等.吉非替尼對博萊霉素致肺纖維化小鼠α平滑肌肌動蛋白的抑制作用［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，30(12):2675-2678.

［6］Voutsadakis IA.The ubiquitin-proteasome system and signal transduction pathways regulating epithelial mesenchymal transition of cancer［J］.J Biomed Sci，2012，19: 67.

［7］Nho RS，Hergert P，Kahm J，et al.Pathological alteration of FoxO3a activity promotes idiopathic pulmonary fibrosis fibroblast proliferation on type I collagen matrix［J］.Am J Pathol，2011，179(5):2420-2430.

［8］Kato M，Yuan H，Xu ZG，et al.Role of the Akt/FoxO3a pathway in TGF-β1-mediated mesangial cell dysfunction:a novel mechanism related to diabetic kidney disease［J］.J Am Soc Nephrol，2006，17(12):3325-3335.

［9］Ganesan S，Unger BL，Comstock AT，et al.Aberrantly activated EGFR contributes to enhanced IL-8 expression in COPD airways epithelial cells via regulation of nuclear FoxO3A［J］.Thorax，2013，68(2):131-141.

［10］Mikawa K，Nishina K，Takao Y，et al.ONO-1714，a nitric oxide synthase inhibitor，attenuates endotoxin-induced acute lung injury in rabbits［J］.Anesth Analg，2003，97 (6):1751-1755.

［11］Ashcroft T，Simpson JM，Timbrell V.Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale［J］.J Clin Pathol，1988，41(4):467-470.

［12］Kim KK，Kugler MC，Wolters PJ，et al.Alveolar epithelial cell mesenchymal transition develops in vivo during pulmonary fibrosis and is regulated by the extracellular matrix［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(35): 13180-13185.

［13］Liu Y.Epithelial to mesenchymal transition in renal fibrogenesis:pathologic significance，molecular mechanism，and therapeutic intervention［J］.J Am Soc Nephrol，2004，15(1):1-12.

［14］Docherty NG，O’Sullivan OE，Healy DA，et al.TGF-β1-induced EMT can occur independently of its proapoptotic effects and is aided by EGF receptor activation［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2006，290(5):R1202-R1212.

［15］Accili D，Arden KC.FoxOs at the crossroads of cellular metabolism，differentiation，and transformation［J］.Cell，2004，117(4):421-426.

Gefitinib inhibitsepithelial-mesenchymaltransition by up-regulating Foxo3a expression in mice with bleomycin-induced lung fibrosis

PENG Ting1，2，DU Hai-jian2，LI Li，LI Wei-feng2，HUANG Wen-jie2
(1Postgraduate Institute of Southern Medical University，Guangzhou 510515，China;2Department of Respiratory Medicine，General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA，Guangzhou 510010，China.E-mail:lwf980622@126.com)

AIM:To identify the effect of gefitinib on the expression of forkhead box protein O3a(Foxo3a)，α-smooth muscle actin(α-SMA)and related signal pathway molecules in the mice with bleomycin-induced lung fibrosis and to investigate the inhibition mechanism of gefitinib on lung epithelial-mesenchymal transition.METHODS:Thirty Kunming female mice were randomly divided into 3 groups:control group(received normal saline intratracheally)，bleomycin group(received bleomycin intratracheally，3 mg/kg)，and bleomycin plus gefitinib group(received bleomycin intratracheally and gefitinib orally，20 mg/kg).All the mice were sacrificed 14 d after the treatments.Pulmonary histological changes were evaluated by hematoxylin-eosin staining and Masson trichrome staining.The mRNA levels of Foxo3a and α-SMA in the lung tissues were detected by RT-PCR.Nuclear Foxo3a，α-SMA，and phosphorylation of EGFR，Akt and Foxo3a in the lung tissues were determined by Western blotting.RESULTS:Gefitinib inhibited bleomycin-induced lung fibrosis and significantly decreased the scores of lung inflammation and fibrosis.Foxo3a mRNA expression and total Foxo3a protein expression were increased，while the phosphorylated Foxo3a was decreased.Nuclear Foxo3a was increased significantly.Meanwhile，phosphorylated EGFR and Akt were decreased.The level of α-SMA was observably increased.CONCLUSION:Gefitinib restores Foxo3a activity and reduces α-SMA expression by modulating EGFR/Akt activity，thus inhibiting bleomycin-induced lung fibrosis.

Gefitinib;Forkhead box protein O3a;Lung fibrosis;Bleomycin;Epithelial-mesenchymal transition

R563

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.011

1000-4718(2014)03-0444-05

2013-11-01

2014-01-13

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.S2011010000511);廣東省科技計劃項(xiàng)目(No.2010B031600122);廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.9151001002000014);吳階平醫(yī)學(xué)基金會臨床科研專項(xiàng)資助基金資助項(xiàng)目(No.320.6750.12330)

△通訊作者Tel:020-88653555;E-mail:lwf980622@126.com