一氧化氮/誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在動(dòng)脈粥樣硬化過程中的作用*

邊 寧， 龔博君， 郭 軍， 黃正一， 李自成

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東廣州 510630)

一氧化氮/誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在動(dòng)脈粥樣硬化過程中的作用*

邊 寧▲， 龔博君▲， 郭 軍， 黃正一， 李自成△

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東廣州 510630)

目的：探討一氧化氮(NO)/誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)過程中的動(dòng)態(tài)變化，分析其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成過程的影響。方法：將60只SD大鼠隨機(jī)分成2組:對(duì)照組及AS組，每組30只。AS組采用維生素D3腹腔注射聯(lián)合高脂飼料飼養(yǎng)的方法構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型。用相關(guān)生化方法檢測(cè)血清各項(xiàng)生化指標(biāo):總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、空腹血糖和鈣離子，比色法檢測(cè)血清NO濃度，并對(duì)主動(dòng)脈行HE染色，免疫組化技術(shù)檢測(cè)iNOS蛋白表達(dá)，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用簡(jiǎn)單線性相關(guān)分析NO與鈣離子及動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果：90 d后成功構(gòu)建了主動(dòng)脈中膜鈣化型動(dòng)脈粥樣硬化模型。血清NO濃度在動(dòng)脈粥樣硬化過程中逐步下降，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。動(dòng)脈粥樣硬化過程中動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)與鈣離子呈正相關(guān)，與NO呈負(fù)相關(guān)。在90 d的AS組粥樣斑塊區(qū)免疫組化技術(shù)檢測(cè)到iNOS蛋白表達(dá)。結(jié)論：在動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中，主動(dòng)脈粥樣斑塊區(qū)iNOS蛋白高表達(dá)，但血清NO濃度逐漸降低，NO抗動(dòng)脈粥樣硬化作用減弱。

動(dòng)脈粥樣硬化;一氧化氮;一氧化氮合酶;鈣

動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病發(fā)生的核心病理基礎(chǔ)。一氧化氮(nitric oxide，NO)既是一種氣體信號(hào)分子，又是一種有效的血管舒張因子［1］，研究報(bào)道其舒張血管作用為一氧化碳的300～1 000倍。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是機(jī)體內(nèi) NO產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，其同功酶有3種亞型［2］:誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)、神經(jīng)元型NOS和內(nèi)皮型NOS。為探究NO/iNOS在動(dòng)脈粥樣硬化過程中的作用，本研究擬采用維生素D3并高脂飼料構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型，通過檢測(cè)血清中NO濃度的動(dòng)態(tài)變化及iNOS在主動(dòng)脈粥樣斑塊中的表達(dá)，以探討NO/iNOS與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系。

材料和方法

1 方法

1.1 動(dòng)物及造模 6～8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體重160～200 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(粵)2008-0002，粵監(jiān)證字為2008A020。隨機(jī)分成2組，對(duì)照組及動(dòng)脈粥樣硬化組(atheroslerosis，AS)組，每組30只。對(duì)照組普通飼料飼養(yǎng)，AS組高脂飼料飼養(yǎng)。高脂飼料配方為:膽固醇4%，膽酸鈉0.5%，豬油10%，白糖5%，丙硫氧嘧啶0.2%，基礎(chǔ)飼料80.3%。生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2008-0002。AS組大鼠于實(shí)驗(yàn)開始前4 d給維生素D36×105U·kg-1·d-1腹腔注射，之后每30 d以3×105U·kg-1·d-1腹腔注射進(jìn)行造模。

1.2 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天、第45天及第90天將動(dòng)物隔夜禁食，并于次日早晨8點(diǎn)10%水合氯醛麻醉后，用生化管腹主動(dòng)脈采血，血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、鈣離子(calcium ion，Ca2+)和空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)濃度分別采用TCH酶法、酶偶聯(lián)比色法、沉淀分離法、酶聯(lián)免疫法和葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測(cè)。動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(atherosclerosis index，AI)計(jì)算公式為:(TC-HDLC)/HDL-C。低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)采用公式計(jì)算:LDL-C= TC-HDL-C。

1.3 血清NO濃度的檢測(cè) NO濃度檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物有限公司，檢測(cè)過程嚴(yán)格遵循測(cè)試盒各項(xiàng)操作流程，采用比色法檢測(cè)。試劑盒測(cè)試原理為:NO在含氧及水的環(huán)境中可生成硝酸鹽及亞硝酸鹽，通過采用硝酸鹽顯示劑能使硝酸鹽及亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化成偶氮化合物，再利用比色法間接測(cè)定血清中NO的濃度。

1.4 腹主動(dòng)脈HE染色 對(duì)AS組90 d和對(duì)照組90 d主動(dòng)脈行HE染色，在取主動(dòng)脈樣本前用4%甲醛行心臟灌洗，分離主動(dòng)脈，將其浸泡于4%甲醛中，時(shí)間控制在24 h內(nèi)，之后以濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明，包埋，切片，并行HE染色。

1.5 免疫組化染色檢測(cè)主動(dòng)脈粥樣斑塊區(qū)iNOS的表達(dá) 兔抗大鼠 iNOS多克隆抗體購自 Abcam。PBS、檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)、即用型封閉血清、3%H2O2、DAB顯色液和即用型免疫組織化學(xué)SP法染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。采用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，操作步驟照試劑盒說明書進(jìn)行。顯微鏡觀察并拍照。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析。用簡(jiǎn)單線性相關(guān)分析動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)與NO和鈣離子的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 血脂指標(biāo)在各組間的比較

AS組90 d TC、TG和HDL-C水平與對(duì)照組90 d比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，AS組90 d TC及LDL-C水平與AS組0 d間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，AS組90 d TC與AS組45 d比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，見表1。

表1 血脂指標(biāo)的比較Table 1.Comparison of the blood lipid parameters(Mean±SD)

2 一般指標(biāo)在各組間的比較

AS組0 d、45 d及90 d空腹血糖和鈣離子水平在3組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)在AS組90 d明顯高于AS組45 d水平(P＜0.05)，見表2。

表2 動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中一般指標(biāo)的比較Table 2.Comparison of common parameters in the process of atherosclerosis(Mean±SD)

3 血清NO濃度在各組間的比較

血清NO濃度在整個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化過程中呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)，在AS組90 d與0 d及45 d間的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，見表3。

表3 血清NO濃度在各組間的比較Table 3.Comparison of concentration of serum NO(Mean±SD)

4 相關(guān)性分析

對(duì)AS組動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)與血清NO間行相關(guān)分析顯示，動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)和血清NO間有相關(guān)性(r=-0.756，P＜0.01);動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)和鈣離子間同樣具有相關(guān)性(r=0.738，P＜0.01)，見圖1、2。

5HE染色

主動(dòng)脈病理學(xué)HE染色結(jié)果，圖3A示對(duì)照組90 d血管結(jié)構(gòu)規(guī)整，中膜梭型平滑肌細(xì)胞清晰可見;圖3B示AS組90 d血管結(jié)構(gòu)不完整，中膜被鈣化灶及斑塊所占據(jù)，灶區(qū)及斑塊區(qū)未見平滑肌細(xì)胞。

6 主動(dòng)脈粥樣斑塊區(qū)域iNOS免疫組化染色

通過對(duì)照組90 d和AS組90 d腹主動(dòng)脈行iNOS免疫組化染色對(duì)比發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組為陰性(圖4A)，AS組90 d在不規(guī)則粥樣斑塊區(qū)可見棕黃色陽性表達(dá)(圖4B)，90 d時(shí)AS組iNOS蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

Figure 1.The correlation between atherosclerotic index and serum NO level in rats.圖1 動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)與血清NO的相關(guān)性

Figure 2.The correlation between atherosclerotic index and serum calcium ion concentration in rats.圖2 動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)與血清鈣離子的相關(guān)性

Figure 3.The changes of atorta in control and AS group(HE staining，×100).A:control group at 90 d;B:atherosclerosis group at 90 d.圖3 SD大鼠主動(dòng)脈HE染色

Figure 4.The expression of iNOS protein in aorta detected by immunohistochemistry(×200).A:control group at 90 d;B:atherosclerosis group at 90 d.圖4 SD大鼠主動(dòng)脈iNOS蛋白的表達(dá)

討論

NO作為上世紀(jì)以來一種研究較熱門的氣體信號(hào)分子。NO/iNOS與動(dòng)脈粥樣硬化［3］等其它心血管病關(guān)系密切。機(jī)體在正常情況下，NO主要在內(nèi)皮型NOS關(guān)鍵酶的催化作用下由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，當(dāng)機(jī)體處于炎癥反應(yīng)等受損狀態(tài)時(shí)，原本平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中處于低活性狀態(tài)下的iNOS被激活。動(dòng)脈粥樣硬化過程中，一方面誘導(dǎo)型NOS催化下產(chǎn)生的NO通過與超氧陰離子結(jié)合生成過氧亞硝基陰離子［4］，另外機(jī)體不對(duì)稱二甲基精氨酸濃度將增高，抑制內(nèi)皮型 NOS表達(dá)［5］，在上述兩方面的綜合作用下，體內(nèi)NO濃度、活性及生物利用度降低，通過促進(jìn)三磷酸鳥苷生成環(huán)磷酸鳥苷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度增高，促進(jìn)血管收縮，此外還可改變內(nèi)皮細(xì)胞通透性，促使血管內(nèi)皮功能紊亂，促進(jìn)血管中膜損壞，加速動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。但具體機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步探究。既往研究報(bào)道原發(fā)性高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化及高脂血癥患者較健康對(duì)照人群比較體內(nèi)NO基礎(chǔ)水平降低，可能與氧化應(yīng)激關(guān)系密切［6］，但此結(jié)論尚未被公認(rèn)。

本研究中，血清NO濃度在動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)態(tài)形成過程中呈現(xiàn)逐步下降趨勢(shì)，前45 d下降幅度低于后45 d，免疫組化結(jié)果顯示AS組90 d時(shí)主動(dòng)脈斑塊區(qū)域iNOS蛋白高表達(dá)，在動(dòng)脈粥樣硬化過程中呈上升趨勢(shì)。既往研究報(bào)道，高脂血癥狀態(tài)下，動(dòng)脈內(nèi)皮產(chǎn)生iNOS增多，使NO釋放增多，該病理狀態(tài)中常存在氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激體系中的超氧陰離子對(duì)機(jī)體所產(chǎn)生 NO以尚未明確的綜合機(jī)制迅速降解［7-8］，這是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化過程中iNOS表達(dá)增多但NO分泌減少的主要原因。本研究中NO呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，iNOS蛋白表達(dá)增多，考慮與既往研究報(bào)道所述氧化應(yīng)激作用有關(guān)。此外動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)作為衡量動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，在本研究中動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)與NO呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果說明了由于動(dòng)脈粥樣硬化過程中NO功能逐步減弱，抗動(dòng)脈粥樣硬化作用減弱，最終導(dǎo)致了動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

鈣離子作為機(jī)體重要的第二信使，其所參與的信號(hào)通路與動(dòng)脈粥樣硬化過程、細(xì)胞凋亡及線粒體功能紊亂等機(jī)制關(guān)系密切。鈣離子內(nèi)流增多導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。既往報(bào)道金屬離子對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成起促進(jìn)作用［9-10］，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中鈣離子濃度顯著高于正常組織［11］。動(dòng)脈粥樣硬化形成過程脂質(zhì)條紋、纖維斑塊及晚期復(fù)合斑塊中組織鈣含量分別為健康血管組織中的13倍、24倍及80倍。本研究中AS組45 d和90 d血清鈣離子濃度顯著高于同時(shí)段對(duì)照組水平，且相關(guān)分析中鈣離子水平與動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)呈正相關(guān)，進(jìn)一步在主動(dòng)脈HE染色中，45 d和90 d血管中膜可見大量鈣化灶及斑塊出現(xiàn)。在上研究結(jié)果提示，鈣穩(wěn)態(tài)失衡與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切。

本研究以鈣超載和高脂血癥為出發(fā)點(diǎn)，采用高脂飼料聯(lián)合維生素D3的方法，成功構(gòu)建了主動(dòng)脈中膜鈣化型動(dòng)脈粥樣硬化模型。通過對(duì)NO/iNOS在動(dòng)脈粥樣硬化過程中的具體變化進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究，發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化過程中斑塊中iNOS蛋白高表達(dá)，血清NO分泌逐漸減少，抗動(dòng)脈粥樣硬化作用逐漸減弱，從而更有利于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。以上研究結(jié)果可為臨床試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)研究提供相關(guān)依據(jù)。

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Effects of nitric oxide and inducible nitric oxide synthase on process of atherosclerosis

BIAN Ning，GONG Bo-jun，GUO Jun，HUANG Zheng-yi，LI Zi-cheng
(Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510630，China.E-mail:zichengli @163.net)

AIM:To explore the dynamic changes of nitric oxide and inducible nitric oxide synthase during the process of atherosclerosis，and to analyze their influence on the formation of atherosclerosis.METHODS:SD rats(n= 60)were randomly divided into control group and atherosclerosis group(30 rats in each group).Atherosclerosis model was induced by feeding high-fat diet and vitamin D3.The values of blood biochemical were analyzed enzymatically using bioMérieux kit.The concentration of serum nitric oxideing was detected by a colorimetric method.The success of atherosclerosis modeling was determined by pathological examination.The protein expression of inducible nitric oxide synthase in atherosclerotic plaque was detected by the method of immunohistochemistry.RESULTS:The atherosclerosis model was successfully established in 90 d.The concentration of serum nitric oxide gradually decreased in atherosclerosis group，and a significant difference among groups was observed.Atherosclerosis index was positively correlated with calcium ion，and negatively correlated with nitric oxide.The protein expression of inducible nitric oxide synthase in the atherosclerotic plaque after 90 d was found.CONCLUSION:The protein expression of inducible nitric oxide synthase in the plaque area of aorta increases and the concentration of serum nitric oxide decreases with the process of atherosclerosis.The anti-atherosclerosis role of nitric oxide is gradually decreased.

Atherosclerosis;Nitric oxide;Nitric oxide synthase;Calcium

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.006

1000-4718(2014)03-0414-05

2013-12-27

2014-01-04

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.20101096136);廣州市科技計(jì)劃(No.2010Y1-C941);暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)

學(xué)科基金(No.2010-4)

△通訊作者Tel:020-38688620;E-mail:zichengli@163.net

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