納米氧化鋁亞慢性染毒致小鼠神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷機制

郭衛(wèi)偉，常麗俊，丁 勇，李 歡，葛翠翠，王海洋，張勤麗，牛 僑

(山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生教研室，山西太原 030001)

納米氧化鋁，作為一種新型的材料，由于其空間結(jié)構(gòu)的特殊性而表現(xiàn)出與傳統(tǒng)材料不同的特性(表面效應(yīng)，小尺寸效應(yīng)，宏觀量子隧道效應(yīng)及量子尺寸效應(yīng))，并被應(yīng)用于人工晶體、高效催化劑、涂料、高溫陶瓷、密封黏結(jié)劑、醫(yī)藥、激光材料及屏蔽材料等［1］，因此，納米氧化鋁材料的人體生物學(xué)效應(yīng)研究，顯得尤為必要。由于納米顆粒的理化特性，可以沉積到鼻腔上腔黏膜，再通過嗅球遷移到腦組織其他部位［2］，因此，本實驗采用滴鼻染毒方式研究納米氧化鋁顆粒的神經(jīng)毒性。

線粒體作為活性氧和ATP產(chǎn)生的主要細(xì)胞器。在細(xì)胞受到刺激時，線粒體的數(shù)量、大小及結(jié)構(gòu)可發(fā)生病理性改變，從而調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生存或死亡。Chen等［3］對納米氧化鋁進行體內(nèi)外研究，發(fā)現(xiàn)線粒體是納米氧化鋁顆粒的主要靶細(xì)胞器之一。同時，線粒體功能失調(diào)也是眾多中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的早期特征。Tanaka等［4］發(fā)現(xiàn)線粒體功能紊亂可損傷小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。自噬可作為線粒體質(zhì)量的主要調(diào)控機制之一［5－6］。Khan 等［7］發(fā)現(xiàn)，氧化鐵納米顆?？蓳p失細(xì)胞中的線粒體，同時細(xì)胞的自噬與線粒體的損傷程度成正相關(guān)。同時一些研究認(rèn)為，自噬也可能引起細(xì)胞的死亡［8－10］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度納米氧化鋁致原代神經(jīng)元線粒體膜電位降低，小鼠的空間記憶能力顯著降低［11－12］。在前期研究結(jié)果基礎(chǔ)上，本實驗觀察納米氧化鋁對神經(jīng)細(xì)胞線粒體的損傷，進一步探討損傷神經(jīng)細(xì)胞的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

納米氧化鋁(＜50 nm)(美國Sigma公司);組織蛋白抽提試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);超微量ATP酶測定試劑 盒 (Na+－K+－ATPase、Ca2+－Mg2+－ATPase)(南京建成科技有限公司);微管相關(guān)蛋白輕鏈3(light chain 3，LC3)抗體(日本 Medical＆ Biological Laboratories公司);Beclin1抗體(美國Proteintech Group公司);細(xì)胞素c氧化酶亞單位Ⅳ(cytochrome c oxidaseⅣ，COXⅣ)抗體(美國Proteintech Group公司);抗β肌動蛋白鼠單克隆抗體(北京康為世紀(jì)科技有限公司);抗GAPDH鼠單克隆抗體(北京康為世紀(jì)科技有限公司);山羊抗小鼠IgG(H+L)，HRP(北京康為世紀(jì)科技有限公司);兔抗山羊IgG(美國Jackson Immuno Research公司);e－ECL發(fā)光液(北京康為世紀(jì)科技有限公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

超聲波破碎儀(Sonics＆Material Inc.，美國);酶標(biāo)儀(美國Becton Dickinson公司);DYY－12型電泳儀電源(北京六一儀器廠);2600C自動X射線膠片洗片機(上海申貝總公司電影機械廠);捷達801系列凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)(江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司);透射電鏡(JEM－100CX，Japan)。

1.2 納米氧化鋁(＜50 nm)懸液的制備與表征

納米氧化鋁顆粒溶于生理鹽水中，制成相應(yīng)濃度的懸液。超聲 30 min后，電子顯微鏡(×80 000)觀察納米氧化鋁顆粒，呈規(guī)則分布均勻的球形，平均粒徑為(112±24)nm。靜置1 h后，納米氧化鋁顆粒粒徑和分布無顯著變化。因此，染毒期間納米顆粒的形狀及分散程度沒有明顯變化。

Fig.1 Distribution of 50 nm Al2O3after ultrasonic(A)and on standing for 1 h after ultrasonic(B).

1.3 動物分組及染毒后處理

健康成年雌性ICR小鼠40只，體質(zhì)量20～25 g，由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證編號:SCXK(京)2011－0012。動物房以自然節(jié)律采光，溫度20～25℃，濕度40% ～60%，清潔，安靜。小鼠自由進食飲水，適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機分為4組:生理鹽水對照組，納米氧化鋁25，50和75 mg·kg－1。每天鼻腔滴注3 次，每次10 μL，約50 min，連續(xù)染毒30 d。染毒過程中，均勻緩慢滴注兩側(cè)鼻孔，待鼻腔中未排出液體再放回鼠籠，每只滴注需要約1 min左右，連續(xù)染毒1個月。染毒結(jié)束后，經(jīng)過7 d的行為學(xué)檢測后，立即處死小鼠。

1.4 海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

各組分別剝?nèi)?只小鼠海馬CA3區(qū)的組織塊(約1 mm2大小)，快速放入固定液中，固定后經(jīng)漂洗，脫水和滲透過程，鏡檢;并通過Olympus分析軟件測量線粒體粒徑。

1.5 線粒體 Na+－K+－ATPase 與 Ca2+－Mg2+－ATPase活力測定

各組選取3只小鼠處死，取新鮮大腦皮質(zhì)100 g，采用差速離心法，粗提細(xì)胞線粒體(即鏡檢細(xì)胞中不存圈的亮環(huán)數(shù)達70% ～80%)，溶解于0.1 mL預(yù)冷的活性裂解液(Tris·HCl 20 mmol·L－1pH 7.5，EGTA 2 mmol·L－1，EDTA 2 mmol·L－1，1%Trion－100，每毫升線粒體活性裂解液加入1 μL蛋白酶抑制劑和1 μL DTT)，冰上放置100 min，再渦旋振蕩30 s，4℃，15 000 ×g，離心10 min，取上清液，按照說明書測定酶活力。

1.6 Western蛋白印跡法檢測COXⅣ，Beclin 1及LC3表達

各組選取3只小鼠處死，剝?nèi)〈竽X皮質(zhì)，－80℃凍存，按試劑盒說明書抽提組織蛋白，用BCA法蛋白定量，加等體積的2×上樣緩沖液，煮沸5 min，制成樣品。凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析條帶積分吸光度值。以β肌動蛋白，GAPDH為內(nèi)參。分別用COXⅣ/β肌動蛋白，Beclin 1/GAPDH，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的積分吸光度值比例表示相應(yīng)蛋白的表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 納米氧化鋁對小鼠神經(jīng)細(xì)胞線粒體的影響

圖2A與B所示，納米氧化鋁0與25 mg·kg－1組線粒體形態(tài)呈線狀，嵴結(jié)構(gòu)完整和密度緊密。而納米氧化鋁50 mg·kg－1組線粒體明顯腫脹，內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)排列稀疏，核周線粒體呈空泡化(圖2C1，C2)。納米氧化鋁75 mg·kg－1組線粒體大多呈微球形，嵴結(jié)構(gòu)完整但密度增強(圖2D1，D2)。線粒體的平均粒徑如表1所示，納米氧化鋁50 mg·kg－1組分別是0 與25 mg·kg－1組的1.4 倍與1.5 倍(P ＜0.05)。而75 mg·kg－1組卻是 50 mg·kg－1組的 73%(P ＜0.05)。

Fig.2 Morphological changes in the mitochondrion in CA3 regions of the nerve cell in the ICR mouse treated with Al2O3nanoparticles detected bytransmission electron microscopy.The mouse treated with nano－alumina(＜ 50 nm)by nasal inhalation for 1 month.A:nano－Al2O3 0 mg·kg －1group;B:nano－Al2O325 mg·kg －1group;C:nano－Al2O350 mg·kg －1group;D:nano－Al2O375 mg·kg －1group.1:showed the whole nerve cell;2:the part of 1.Arrows showed the mitochondrion.

Tab.1 Effect of nano－alumina on the diameter of the mitochondrion of nerve cells

2.2 納米氧化鋁對線粒體 Na+－K+－ATPase與Ca2+－Mg2+－ATPase 活力的影響

表2結(jié)果顯示，納米氧化鋁引起線粒體Na+－K+－ATPase 和 Ca2+－Mg2+－ATPase 活力顯著下降(P＜0.05)。與正常對照組相比，納米氧化鋁50和75 mg·kg－1組 Na+－K+－ATPase 活力分別下降52%和 58%(P ＜0.05)，Ca2+－Mg2+－ATPase 活力分別下降51%和50%。與25 mg·kg－1組相比，納米氧化鋁50和75 mg·kg－1組分別降低43%和50%(P ＜0.05)。

Tab.2 Effect of nano－alumina(＜ 50 nm)on the enzyme activities of Na+ －K+ －ATPase and Ca2+－Mg2+－ATPase in mitochondria

2.3 納米氧化鋁對皮質(zhì)COXⅣ，Beclin 1，LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白表達的影響

Western電泳結(jié)果(圖3)及半定量數(shù)據(jù)結(jié)果(表3)顯示，納米氧化鋁75 mg·kg－1組 COXⅣ蛋白表達顯著下降(P＜0.05);其他劑量組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。說明納米氧化鋁75 mg·kg－1顯著降低線粒體的數(shù)量。納米氧化鋁75 mg·kg－1組蛋白Beclin 1表達量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例顯著增加，正常對照組的1.4 和2.1 倍(P＜0.05)。

Fig.3 Effect of nano－alumina(＜ 50 nm)on the expression of cytochrome c oxidaseⅣ(COXⅣ)(A)，Beclin 1(B)and light chain 3Ⅱ(LC3Ⅱ)/LC3Ⅰ(C)proteins in cerebral cortex.See Fig.1 for the treatment.Lane1 －4:nano－Al2O30，25，50 and 75 mg·kg－1，respectively.

Tab.3 Effect of nano－alumina(＜50 nm)on the expression of COX－Ⅳ，Beclin1 and LC3Ⅱ/LC3Ⅰproteins in cerebral cortex

3 討論

本研究顯示，納米氧化鋁能夠引起線粒體結(jié)構(gòu)明顯的形態(tài)學(xué)改變;同時暴露于不同濃度納米氧化鋁的線粒體粒徑存在統(tǒng)計學(xué)差異，從定量水平進一步說明了線粒體結(jié)構(gòu)的損傷。同時，隨著納米氧化鋁濃度的升高，Na+－K+－ATPase 和 Ca2+－Mg2+－ATPase活力，COX－Ⅳ蛋白的表達明顯下降，而自噬相關(guān)蛋白的表達量明顯升高。COX－Ⅳ蛋白作為線粒體的標(biāo)志蛋白，可以用來對線粒體數(shù)量進行定量檢測［13］。綜上表明，納米氧化鋁可明顯損傷神經(jīng)細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)并引起功能及數(shù)量的下降，而受損的線粒體受到機體的自噬清除。Lin等［14］研究發(fā)現(xiàn)，ICR小鼠經(jīng)靜脈注射不同濃度的量子點705，神經(jīng)細(xì)胞的線粒體呈現(xiàn)漸進性變化，線粒體腫脹或代償性肥大，最后可見微球形線粒體增生，而這些微線粒體可能是功能低下的新生線粒體。Narendra等［15］認(rèn)為，線粒體的調(diào)控性降解與線粒體的分離密切相關(guān)。因此，本研究中納米氧化鋁損傷線粒體結(jié)構(gòu)，并可能引起幼稚線粒體增生，而這加重酶活力的下降。酶活力的降低可間接表明納米氧化鋁影響線粒體的供能，但線粒體ATP含量的變化還需進一步的檢測。機體通過自噬清除受損的線粒體，進一步解釋了線粒體數(shù)量的下降。Chen等［16］研究發(fā)現(xiàn)，自噬可能是納米氧化鋁介導(dǎo)細(xì)胞毒性的主要機制。在本研究中，自噬在清除受損線粒體的同時，也可能通過對線粒體質(zhì)量的調(diào)控而影響神經(jīng)細(xì)胞功能。但也有研究報道，納米顆粒損傷線粒體的同時，也可引起細(xì)胞的凋亡或壞死［17－18］。

綜上所述，納米氧化鋁可損傷神經(jīng)元線粒體，激活細(xì)胞內(nèi)的自噬途徑。然而，線粒體的分離增生，并未引起線粒體數(shù)量的增加;同時，在納米氧化鋁誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生，是否存在其他死亡方式，均需進行更進一步研究。

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