硫辛酸膠囊含量測(cè)定及其穩(wěn)定性

馬宏達(dá)，胡北，吳瓊，崔英宇，史國(guó)兵

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，沈陽 110016)

硫辛酸膠囊含量測(cè)定及其穩(wěn)定性

馬宏達(dá)，胡北，吳瓊，崔英宇，史國(guó)兵

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，沈陽 110016)

目的 建立測(cè)定硫辛酸膠囊中硫辛酸含量的反相高效液相色譜(RP-HPLC)法,并考察其穩(wěn)定性。方法采用RP-HPLC法測(cè)定硫辛酸的含量。采用Diamonsil C18色譜柱,流動(dòng)相為乙腈-0.15%磷酸(38∶62),檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。采用影響因素實(shí)驗(yàn)、加速實(shí)驗(yàn)和長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)考察硫辛酸膠囊穩(wěn)定性。結(jié)果硫辛酸濃度在5～500 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;平均回收率99.23%,精密度、穩(wěn)定性等均符合測(cè)定要求。硫辛酸對(duì)光照較敏感,在市售包裝下,穩(wěn)定性較好。結(jié)論RP-HPLC法操作簡(jiǎn)單,結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性好,可用于硫辛酸的含量測(cè)定。硫辛酸在避光、室溫條件下,能較長(zhǎng)時(shí)間保存。

硫辛酸；含量測(cè)定；穩(wěn)定性；色譜法,高效液相,反相

硫辛酸(alpha lipoic acid)的化學(xué)名為(±)[3-(1, 2-二硫雜環(huán)戊烷)]-戊酸(1,2-dithiolane-3-pentanoic acid.),其氧化性和還原性可以互相轉(zhuǎn)化[1]。硫辛酸具備一般抗氧化劑所不能及的抗氧化性[2],它作為線粒體中丙酮酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶的輔酶,在細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮重要作用[3-4]。硫辛酸能有效控制血糖,消除氧自由基,螯合金屬離子,再生其他抗氧化藥,是強(qiáng)效多功能氧化應(yīng)激抑制藥,在改善人的體質(zhì),抗氧化,以及糖代謝、糖尿病并發(fā)癥和其他多種疾病治療方面?zhèn)涫荜P(guān)注[5]。文獻(xiàn)報(bào)道采用電化學(xué)檢測(cè)法[6]、脈沖安培檢測(cè)法[7]或熒光檢測(cè)法[8]等方法進(jìn)行測(cè)定。筆者在本研究中采用反相高效液相色譜法,建立了硫辛酸膠囊的含量測(cè)定方法,該方法操作簡(jiǎn)單,結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜系統(tǒng)(包括600泵, 2487檢測(cè)器),KQ3200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),AUW120D型分析天平(島津公司)。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)箱(重慶市永生實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.2 試藥 硫辛酸對(duì)照品(Sigma公司,批號(hào):100588-200501),乙腈(色譜純,Fisher公司),水為雙蒸水,其他試劑為化學(xué)純。硫辛酸膠囊為沈陽軍區(qū)總醫(yī)院制劑研發(fā)室提供(批號(hào):20110901,20110902,20110903)。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 溶液的配制 對(duì)照品溶液的制備:取硫辛酸對(duì)照品5 mg精密稱定,置于100 mL棕色量瓶,加入適量乙腈∶水(1∶1)溶液超聲溶解,取出后放至室溫,定容,濾過,得到50 μg·mL-1對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備:取硫辛酸膠囊20粒,倒出內(nèi)容物混合均勻。取內(nèi)容物適量(約相當(dāng)于硫辛酸5 mg)精密稱定,置于100 mL棕色量瓶,加入適量乙腈∶水(1∶1)溶液超聲溶解,取出后放至室溫,定容,濾過,取續(xù)濾液得到硫辛酸供試品溶液。

2.1.2 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(5 μm,200× 4.6 mm,Dikma公司);流動(dòng)相:乙腈∶0.15%磷酸= 38∶62;流速:1 mL·min-1;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:25℃。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取硫辛酸對(duì)照品適量,溶于適量乙腈∶水(1∶1)溶液,稀釋至適宜濃度后,在波長(zhǎng)200～400 nm范圍內(nèi)掃描測(cè)定。根據(jù)掃描結(jié)果可知,硫辛酸無顯著最大吸收波長(zhǎng),因此選用220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.4 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別取硫辛酸對(duì)照品溶液、供試品溶液、不含硫辛酸的陰性溶液各20 μL,注入HPLC系統(tǒng),色譜圖見圖1。由色譜圖可知,硫辛酸在此色譜條件下峰形良好,保留時(shí)間約12.3 min,與其他色譜峰分離良好,表明處方中其他輔料成分對(duì)硫辛酸的測(cè)定無干擾,該色譜方法專屬性較強(qiáng)。

圖1 3種溶液高效液相色譜圖A.空白輔料;B.對(duì)照品溶液;C.樣品溶液;1.硫辛酸Fig.1 HPLC chromatogram of lipoic acidA.negative sample;B.reference substance;C.sample;1. 1ipoic acid

2.1.5 線性關(guān)系考察 取硫辛酸對(duì)照品適量精密稱定,置于棕色量瓶,加入適量乙腈∶水(1∶1)溶液,超聲5 min溶解,定容,配制硫辛酸對(duì)照品溶液,使其濃度為5,10,20,50,100,200和500 μg·mL-1。按上述色譜條件注入HPLC系統(tǒng),記錄色譜圖。以峰面積(A)為縱坐標(biāo),硫辛酸濃度(C)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=7 176.686C-5 053.425,r= 0.999 9。由此可知,硫辛酸在5～500 μg·mL-1范圍內(nèi),其濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.6 檢測(cè)限 取硫辛酸對(duì)照品溶液作為母液,采用乙腈∶水(1∶1)溶液逐級(jí)倍比稀釋,將稀釋后的溶液注入高效液相色譜系統(tǒng),記錄色譜圖,當(dāng)信噪比為3時(shí),計(jì)算該色譜條件下的檢測(cè)限。經(jīng)計(jì)算,檢測(cè)限為16.6 ng。

2.1.7 精密度實(shí)驗(yàn) 取50 μg·mL-1硫辛酸對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,計(jì)算日內(nèi)精密度,連續(xù)進(jìn)樣3 d,計(jì)算日間精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,硫辛酸日內(nèi)精密度0.59%,日間精密度0.74%,說明該方法精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液,每隔2 h進(jìn)樣一次,分別于0,2,4,6,8,10,12 h進(jìn)樣,記錄硫辛酸色譜峰面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,穩(wěn)定性RSD為0.59%,表明硫辛酸供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批硫辛酸膠囊,制備供試品溶液,共6份,按上述色譜方法測(cè)定,外標(biāo)法計(jì)算硫辛酸含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,硫辛酸在樣品平均含量為標(biāo)示量的99.92%,重現(xiàn)性RSD為0.79%,表明該色譜方法重復(fù)性良好。

2.1.10 回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的硫辛酸膠囊50粒,倒出內(nèi)容物混合均勻。取內(nèi)容物適量精密稱定,共9份,再分別加入硫辛酸樣品的80%、100%、120%的硫辛酸對(duì)照品,每樣各3份,按“2.1.1”項(xiàng)方法制備成供試溶液。分別取20 μL,外標(biāo)法測(cè)定硫辛酸含量,計(jì)算樣品回收率,結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,方法平均回收率99.23%,RSD為1.64%,此方法回收率良好。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery test mg,n=9

2.1.11 樣品測(cè)定 取硫辛酸膠囊20粒,倒出內(nèi)容物混合均勻。取內(nèi)容物適量(相當(dāng)于硫辛酸5 mg)精密稱定,置于100 mL棕色量瓶,加入適量乙腈∶水(1∶1)溶液超聲溶解,取出后放至室溫,定容,濾過,取續(xù)濾液得到硫辛酸供試品溶液。取供試品溶液20 μL,注入高效液相色譜系統(tǒng),記錄峰面積,外標(biāo)法計(jì)算硫辛酸含量。共測(cè)定了3批硫辛酸膠囊,硫辛酸含量分別為標(biāo)示量的99.92%,99.17%和100.84%,均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.2 穩(wěn)定性考察

2.2.1 影響因素實(shí)驗(yàn) 高溫實(shí)驗(yàn):取適量硫辛酸膠囊,置于培養(yǎng)皿,置于穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)箱,在40℃下放置10 d,分別于放置后5,10 d取樣,觀察內(nèi)容物性狀變化,并測(cè)定硫辛酸含量變化。

高濕實(shí)驗(yàn):取適量硫辛酸膠囊,置于培養(yǎng)皿,置于穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)箱,分別在相對(duì)濕度92.5%環(huán)境中下放置10 d,分別于放置后5,10 d取樣,觀察內(nèi)容物性狀變化及吸濕增重,并測(cè)定硫辛酸含量變化。

強(qiáng)光實(shí)驗(yàn):取適量硫辛酸膠囊放置于培養(yǎng)皿,置于穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)箱,在相當(dāng)于照度(4 000±500)Lx環(huán)境中下放置10 d,分別于放置后5,10 d取樣,觀察內(nèi)容物性狀變化,并測(cè)定硫辛酸含量變化。結(jié)果見表2。

表2 影響因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of test on influential factor

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高溫(40℃)、高濕對(duì)硫辛酸的穩(wěn)定性基本沒有影響,強(qiáng)光照射對(duì)硫辛酸的性狀及含量有較大影響。提示硫辛酸制劑應(yīng)放置在陰涼處,避光保存。

2.2.2 加速實(shí)驗(yàn) 取市售包裝硫辛酸膠囊3批,置于(40±2)℃、相對(duì)濕度(75±5)%恒溫恒濕箱中,分別在0,1,2,3,6個(gè)月,取樣測(cè)定有關(guān)質(zhì)量指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本品經(jīng)加速實(shí)驗(yàn)考察6個(gè)月,各項(xiàng)指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)前比較,內(nèi)容物性狀和硫辛酸含量均無變化,符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2.2.3 長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn) 取市售包裝硫辛酸膠囊3批,置于(25±2)℃、相對(duì)濕度(60±10)%恒溫恒濕箱中,分別在0,3,6個(gè)月,取樣測(cè)定有關(guān)質(zhì)量指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本品經(jīng)室溫留樣觀察法考察6個(gè)月,各項(xiàng)指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)前比較,內(nèi)容物性狀和硫辛酸含量均無變化,符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

3 討論

筆者本實(shí)驗(yàn)還考察了流動(dòng)相種類,有機(jī)相分別考察了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈,水相分別考察了磷酸、磷酸二氫鉀溶液、磷酸二氫鈉溶液等,對(duì)硫辛酸色譜峰的影響。結(jié)果表明,乙腈∶0.15%磷酸作為流動(dòng)相,硫辛酸的分離效果較好,拖尾因子較小,峰型良好,柱效較高,同時(shí)液相系統(tǒng)配制較為簡(jiǎn)便。

本研究采用反相高效液相色譜法,建立的硫辛酸膠囊含量的測(cè)定方法。具有操作簡(jiǎn)單,重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn),具有較強(qiáng)的專屬性和準(zhǔn)確性,適合于硫辛酸的含量測(cè)定。

筆者也考察了60℃下硫辛酸的高溫影響因素實(shí)驗(yàn),但硫辛酸的熔點(diǎn)為60～61℃,硫辛酸在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)箱中融化,因此本研究高溫實(shí)驗(yàn)選擇在40℃下檢測(cè)。高溫(40℃)、高濕對(duì)硫辛酸基本沒有影響。但在強(qiáng)光照射下含量明顯下降并伴有顏色改變,說明硫辛酸對(duì)強(qiáng)光照射比較敏感,最好避光放置。并且經(jīng)過加速實(shí)驗(yàn)及長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)考察,結(jié)果表明硫辛酸膠囊穩(wěn)定性良好。

[1] REED L J.A trail of research from lipoic acid to alpha-keto acid dehydrogenase complexes[J].J Biol Chem,2001,276 (42):38329-38336.

[2] PACKER L,WITT E H,TRITSCHLER H J.Alpha-lipoic acid as a biological antioxidant[J].Free Radic Biol Med, 1995,19(2):227-250.

[3] SMITH A R,SHENVI S V,WIDLA M,et al.Lipoic acid as a potential therapy for chronic diseases associated with oxidative stress[J].Curr Med Chem,2004,11:1135-1146.

[4] MAY J M,QU Z C,NELSN D J.Uptake and reduction of alpha-lipoic acid by human erythrocytes[J].Clin Biochem, 2007,40(15):1135-1142.

[5] 湯春芳,劉云國(guó),徐衛(wèi)華,等.硫辛酸的研究概況[J].中國(guó)生化藥物雜志,2005,26(1):52-55.

[6] TEICHERT J,PRISS R.Determination of lipoic acidin human plasma by high performance liquid chromatography with electrochemical detection[J].J Chromatogr B Biomed Appl, 1995,672(2):277-284.

[7] TEICHERT J,PREISS R.High-performance liquid chromatographic assay for alpha-lipoic acid and five of its metabolites in human plasma and urine[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2002,769(2):269-281.

[8] BERNKOP-SCHNURCH A,REICH-ROHRWIG E,MARSCHUTZ M,et a1.Development of in human release dosage form for α-Lipoic Acid.II.evaluation in human volunteers [J].Drug Dev Ind Pharm,2004,30(1):35-41.

DOI 10.3870/yydb.2014.03.027

Content Determination of Alpha Lipoic Acid Capsule and Its Stability Study

MA Hong-da,HU Bei,WU Qiong,CUI Ying-yu,SHI Guo-bing
(Department of Pharmacy,General Hospital of Shenyang Military Area Command,Shenyang 110016,China)

Objective To establish RP-HPLC method for content determination of alpha lipoic acid tablets and investigate its stability.MethodsThe RP-HPLC method was performed on an iamonsil C18column with a mobile phase of acetonitrile-0.15%phosphoric acid(38∶62).The detection wavelenth was set at 220 nm.The stability was investigated by stressing testing,accelerated testing and long-term testing.ResultsThe linearity range of pidotimod was 5-500 μg·mL-1,and the average recovery was 99.23%.Alpha lipoic acid is light sensitive,but stable in the marketed packaging.The precision and stability conform to the requirements.ConclusionThe RP-HPLC method is simple,accurate and reproducible,and can be used to determine the content of alpha lipoic acid.Alpha lipoic acid can be stored under the room temperature by avoiding sunlight.

Alpha lipoic acid;Content determination;Stability;RP-HPLC

R977;R927.2

A

1004-0781(2014)03-0367-03

2013-06-06

2013-08-01

馬宏達(dá)(1976-),男,遼寧新民人,主管藥師,博士,研究方向:藥劑學(xué)。電話:024-28851751,E-mail：mahongdamahongda@163.com。

史國(guó)兵(1966-),男,山東文登人,主任藥師,博士,研究方向:臨床藥學(xué)。電話:024-28856262,E-mail：sysgb@126.com。