PM2.5暴露對大鼠行為學及器官的急性毒理作用

李 峰,石 輝

西安建筑科技大學環(huán)境與市政工程學院,西安,710055

在不同的生理和病理狀態(tài)下,機體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)按照一定規(guī)律發(fā)生相應的變化,在污染環(huán)境中運動會影響機體的運動能力,造成特異性、非特異性免疫的損害[1]。且運動強度越大,呼入的顆粒物越多,對機體健康的危害越大[2]。卒中指數(shù)是評判缺血性腦卒中后大腦損傷程度的重要依據(jù),它對神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損的評定起著重要作用[3]。同時機體抗氧化-免疫系統(tǒng)的變化也可以作為機體生理反應、疲勞程度的依據(jù)。研究認為,多種細胞因子的活性改變是運動引起免疫功能變化的內(nèi)在機制[4],而細胞因子的過度和不適當表達會引起一系列疾病[5]。因此,本實驗通過測定不同濃度PM2.5暴露下運動大鼠行為學、抗氧化及免疫指標的變化,探討PM2.5暴露對運動狀態(tài)下機體的急性毒理作用及其可能的機制。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 PM2.5的采樣及懸液制備

用TH-150C型(武漢天虹)大容量大氣總顆粒物智能采樣器(配加2.5 μm的切割器)進行 PM2.5的采樣,采樣時間持續(xù)30 d,每天連續(xù)采樣24 h。采樣地點為某體育館內(nèi),周圍無障礙物遮擋且為非污染源,采樣前將采樣儀器放置高度為1.5 m,即人體呼吸帶高度,采用同心圓方式選取5個點,兩點之間相距5 m左右,離墻 ＞1 m、離門窗 ＞3 m,空氣流量為 1.13 m3·min-1。采樣時將已稱重的濾膜用鑷子放入結晶采樣夾的濾網(wǎng)上,濾膜毛面朝進氣方向,將濾膜壓緊至不漏氣。采樣結束以后用鑷子取出濾膜,將有塵面兩次對折放入樣品紙袋并做好采樣記錄。將濾膜放在25℃,50%相對濕度的恒溫恒濕箱中平衡24 h,在此平衡條件下用感量為0.01 mg的分析天平稱量濾膜,記錄濾膜質(zhì)量,然后將同一濾膜再恒溫恒濕箱中同樣的條件下再平衡1 h后稱重,兩次重量之差小于0.04 mg為滿足恒重要求。根據(jù)采樣前、后濾膜質(zhì)量差和采樣體積得出顆粒物的質(zhì)量濃度。

懸液制備:將載有PM2.5的濾膜裁剪為小塊,浸入去離子水中,超聲振蕩30 min×4次,洗脫顆粒物,震蕩液經(jīng)6層紗布過濾,濾液4℃ 1 000 rm·min-1離心20 min后收集下層懸液冷凍,PM2.5在-20℃保存。染毒時,用0.9%生理鹽水配制成需要的濃度,使用前超聲振蕩混勻,滅菌備用。為保證顆粒物的實際毒性效果,未對顆粒物進行消毒滅菌處理。

1.2 儀器與試劑

儀器:電動跑臺(中國杭州段氏制作公司);DK-98-1A恒溫浴鍋(天津泰斯特有限公司);TN-100托盤扭力天平(武漢自動化儀表廠);Bonso-TCS-2000A電子稱(武漢自動化儀表廠);MR23i型低溫高速離心機(美國Thermo公司);TH-150C型大容量大氣總顆粒物智能采樣器(武漢天虹);BECKMAN AD 340化學發(fā)光酶標儀(美國)。

試劑:GSH-Px和ROS試劑盒購自南京建成生物工程研究所,NF-κΒ和MCP-1試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.3 實驗動物分組與運動方案

實驗大鼠選用健康成年雄性SPF級Wistar大鼠32只,由西安交通大學醫(yī)學院動物房提供(實驗動物生產(chǎn)許可證號為:SCXK(陜)2012-003),鼠齡7周,體重180～220 g。大鼠購入后適應性喂養(yǎng)一周,自由進食飲水(飼料購自西安交通大學醫(yī)學院動物房,生產(chǎn)廠家為西安秦樂飼料有限公司),動物飼養(yǎng)室內(nèi)溫度(20～26)℃,濕度為44% ～70%,照明隨同自然變化。實驗中對大鼠的處置按照中華人民共和國科學技術部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》的相關要求進行[6]。將所有大鼠隨機分為EC,LPE,MPE和HPE,按照每千克體重3 mL的劑量進行設計。實驗動物每組8只,適應性喂養(yǎng)一周后,所有大鼠先以 10 m·min-1、5 min·d-1的跑臺運動進行2 d的適應性訓練,休息1 d后即按照設定的運動方案進行一次遞增負荷訓練,具體訓練方案為:15 m·min-1×15 min,18 m·min-1×20 min,21 m·min-1×30 min,24 m·min-1×40 min,27 m·min-1×50 min的遞增負荷形式進行。

1.4 實驗動物染毒劑量與染毒方式

PM2.5染毒采用氣管滴注法,滴注前受試動物的溫度維持在37℃左右。具體染毒時間為訓練前1 h,在乙醚麻醉后,染毒懸液預溫至37℃,經(jīng)氣管注入PM2.5顆粒物染毒懸液,滴注體積為 3 mL·(kg·bw)-1[7],注入后立即將大鼠直立并旋轉(zhuǎn),使顆粒物盡量均勻分布,對照組滴注同等容量的生理鹽水。

1.5 組織勻漿制備及指標測試

大鼠在運動結束后即可處死,稱取適量肺、肝臟、股四頭肌組織加入0.9%的生理鹽水,按W(g):V(mL)=1:9的比例加取預冷的勻漿介質(zhì)(pH 7.4,0.01 mol·L-1Tris-HCL,0.0001 mol·L-1EDTA-2 Na,0.01 mol·L-1蔗糖,0.8%的NaCl溶液)于燒杯中,用眼科小剪盡快剪碎組織塊(以上全部操作在冰水浴中進行),然后倒入研缽中按照順時針方向進行研磨至糊狀。勻漿液通過二層紗布過濾后按試劑盒要求分別于低溫冷凍離心機4 000 rpm·min-1離心l0 min,分離上清液,4℃冰箱保存?zhèn)溆没蚶洳鼗?20℃冰箱冰凍備用,使用前按照試劑盒要求作相應的稀釋。

指標測試:GSH-Px和ROS采用分光光度計法,NF-κΒ和MCP-1采用ELISA法。

卒中指數(shù)評分[8]:總分25分,0～3分為癥狀組,3～9分為中間組,可能有損傷,≧10分為明顯有損傷。毛發(fā)臟亂顫抖:1分;運動減少或遲鈍:1分;耳觸覺遲鈍:1分;頭翹起:3分;眼固定狀睜開:3分;后肢外展呈“八”字:3分;上瞼下垂:1分;轉(zhuǎn)圈:3分;驚厥或爆發(fā)運動:3分;極度衰弱:6分。

1.6 統(tǒng)計學分析

實驗結果采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理,采用獨立樣本t檢驗,計算均值士標準差,確定差異的顯著性。

2 結果(Results)

2.1 PM2.5暴露對運動大鼠行為學的影響

數(shù)據(jù)顯示,與EC相比,LPE,MPE和HPE組大鼠的卒中得分隨著暴露濃度的增加而升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),見表1。

2.2 PM2.5暴露對肺組織 GSH-Px,ROS,NF-κΒ,MCP-1影響

表2顯示,與EC相比,3種濃度PM2.5暴露后GSH-Px,ROS,NF-κΒ,MCP-1數(shù)值隨著暴露濃度的增大而呈劑量效應關系變化,其中GSH-Px活性下降且MPE組差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01),ROS,NF-κΒ,MCP-1上升差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05或p＜0.01),見表2。

2.3 PM2.5暴露對肝臟組織 GSH-Px,ROS,NF-κΒ,MCP-1的影響

由表3中數(shù)據(jù)可知,和 EC比較,PM2.5暴露后GSH-Px活性下降,MPE,HPE組差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05或P＜0.01);ROS含量升高,差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);NF-κΒ升高差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01);MCP-1上升,MPE,HPE組差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05或p＜0.01),所有指標變化呈劑量相關性變化,見表3

表1 PM2.5暴露對運動大鼠行為學的影響(n=8)Table 1 Effects of PM2.5exposure on behavior of exercise rats(n=8)

2.4 PM2.5暴露對股四頭肌組織GSH-Px,ROS,NF-κΒ,MCP-1的影響

實驗數(shù)據(jù)表明,股四頭肌組織GSH-Px,ROS,NF-κΒ,MCP-1的變化和其它器官表現(xiàn)出一致性,即和EC比較,GSH-Px活性隨著PM2.5暴露濃度的升高而下降;但ROS,NF-κΒ和MCP-1隨著暴露濃度的增加而升高,差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05或p＜0.01),見表 4。

3 討論(Discussion)

3.1 PM2.5暴露對運動大鼠行為學的影響

卒中指數(shù)是評判缺血性腦卒中后大腦損傷程度的重要依據(jù),也是評價機體對應激反應后行為學的指標。適宜的應激水平可以調(diào)節(jié)機體的內(nèi)穩(wěn)態(tài),降低應激引起的皮質(zhì)醇水平,緩解應激造成的行為功能減弱狀況。但較大的應激水平則會造成行為學及某些生理生化指標的紊亂。本實驗結果顯示,和運動組比較,大鼠的卒中得分隨著暴露濃度的增加而升高,差異具有統(tǒng)計學意義,最明顯的癥狀表現(xiàn)在運動減少或遲鈍以及頭翹起,其次為毛發(fā)臟亂顫抖,高濃度組的部分大鼠還出現(xiàn)極度衰弱癥狀。應激反應是一個十分復雜的過程,機體對應激的調(diào)節(jié)作用與個體的健康狀況、運動方式、運動強度、暴露方式和暴露濃度有關。本實驗的結果說明,高濃度的PM2.5暴露會對大鼠的行為學反應造成不良的影響。結合本實驗的抗氧化及免疫數(shù)據(jù)可知,造成這種現(xiàn)象發(fā)生可能是因為PM2.5觸發(fā)或者加劇了機體氧化能力,破壞了氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡,同時免疫能力的降低也許是其中的一個機制。另外,卒中的發(fā)生伴有細胞內(nèi)外信息傳遞的一系列變化,興奮性氨基酸作用于突觸后受體介導的Ca2+超載也許是其產(chǎn)生的原因之一(文章尚未發(fā)表)。但PM2.5暴露是否會造成運動情緒低落從而導致卒中指數(shù)升高還需進一步探討。

3.2 PM2.5暴露對不同組織GSH-Px,ROS,NF-κΒ,MCP-1影響

流行病學和毒理學研究表明,PM2.5的暴露與人體呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病等健康問題密切相關[9-10]。大氣PM2.5氣管滴注染毒后可引起哮喘、支氣管炎、肺部和心血管等疾病[11]。而在對抗顆粒物污染的防御屏障中,機體的抗氧化及免疫系統(tǒng)可以借助抗氧化酶和多種免疫介質(zhì)參與細胞間的相互作用和信息傳遞,從而對機體生理過程進行經(jīng)常性的細胞保護和免疫調(diào)節(jié)。運動可影響人體抗氧化、免疫應答,而這些應答又依賴于運動的強度、間隔時間和運動負荷。在運動應激狀態(tài)下,氧化-抗氧化-免疫網(wǎng)絡的動態(tài)平衡是維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的途徑之一。肺組織是血液氧氣交換的器官,是機體防御的初級屏障[12],肝臟作為機體重要的解毒器官,可以減弱有毒物質(zhì)的危害,而股四頭肌作為運動中血液主要聚集的器官,可以加速血液循環(huán),從而具備載體的作用。

表3 PM2.5暴露對肝臟組織GSH-Px，ROS，NF-κΒ，MCP-1的影響 (n=8)Table 3 Effects of PM2.5exposure on GSH-Px,ROS,NF-κΒ,MCP-1 of liver tissue(n=8)

表4 PM2.5暴露對股四頭肌組織GSH-Px，ROS，NF-κΒ，MCP-1的影響 (n=8)Table 4 Effects of PM2.5exposure on GSH-Px,ROS,NF-κΒ,MCP-1 of quadriceps muscle tissue(n=8)

本實驗3種組織中GSH-Px活性均在PM2.5暴露后呈下降趨勢,且呈劑量相關反應,表明PM2.5對運動機體的抗氧化能力有損傷作用;同時活性氧濃度的升高也證實了機體的氧化能力超過了抗氧化系統(tǒng)的緩沖范圍。細顆粒物在運移和傳輸過程中可吸附有害氣體、重金屬元素、有機污染物以及病毒、細菌等物質(zhì),而這些有毒物質(zhì)可進入呼吸道深處,影響肺泡巨噬細胞的吞噬能力,導致免疫功能下降[13]。同時細顆粒物可通過誘發(fā)細胞內(nèi)產(chǎn)生過量自由基或活性氧,并使細胞抗氧化能力下降而引起細胞膜脂質(zhì)過氧化[14]。運動時肺通過增加肺通氣量和加速代謝來滿足機體的需求,但同時肺通氣量的增加也會加速PM2.5的攝取和轉(zhuǎn)運。大運動量的持續(xù)運動導致骨骼肌產(chǎn)生大量的活性氧,作為細胞內(nèi)主要含硒的抗氧化酶GSH-Px,迅速緩沖活性氧的毒性,然而若機體產(chǎn)生的自由基超過抗氧化酶的緩沖能力時,活性氧會與GSH-Px活性產(chǎn)生競爭性抑制,導致細胞GSH-Px的含量及酶活性降低,酶的還原功能減弱,進而導致氧化應激損傷。PM2.5由肺部進入體內(nèi),與肺上皮細胞和肺巨噬細胞接觸并相互作用釋放出大量的細胞因子和活性氧(ROS),這些ROS以及顆粒物本身攜帶的自由基穿過氣血屏障隨血液循環(huán)進入器官,造成組織內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡失調(diào)。

不同刺激誘導細胞產(chǎn)生的內(nèi)源性活性氧可以作為第二信使,通過改變氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)與細胞增殖、分化及凋亡相關的信號轉(zhuǎn)導通路中多種靶分子的活性,最終決定細胞的命運。NF-κΒ的活化在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[15],活性氧的產(chǎn)生是對氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子NF-κΒ的誘導因素之一,這也許是PM2.5染毒后NF-κΒ升高的一個原因;除了活性氧,細胞氧化狀態(tài)也能夠直接激活NF-κΒ的信號傳導和基因表達,導致細胞外病理生理改變[16]。以前的關于抗氧化劑研究表明,NF-κΒ的激活是氧化敏感的,通過調(diào)節(jié)氧化/抗氧化的平衡可以調(diào)節(jié)其改變[17]。

MCP-1是具有趨化單核細胞和激活單核細胞的雙功能細胞因子,當機體防御系統(tǒng)遭破壞時,MCP-1則在損傷部位可大量表達,通過一定的信號傳導途徑在機體防御、炎癥恢復和抗腫瘤等方面起重要作用[18-19]。在本實驗中 PM2.5染毒后 NF-κΒ和 MCP-1的同時升高說明了二者的協(xié)同作用,其機制可能是PM2.5作用機體后產(chǎn)生的一系列因素綜合作用的結果,比如氧化應激、信號傳導、細胞因子的產(chǎn)生、脂質(zhì)過氧化等[20]。由于MCP-1在急性組織損傷中發(fā)揮著重要的作用,是構成早期抵御微生物侵入的防線,因此MCP-1的升高可以看做是機體對PM2.5毒性刺激的一種保護性反應。

綜上所述,我們認為:(1)本實驗中PM2.5暴露可以顯著降低運動大鼠的行為反應能力和主觀驅(qū)動性;(2)不同濃度PM2.5染毒后大鼠部分器官的抗氧化系和免疫統(tǒng)平衡受到破壞,且各指標的變化與PM2.5濃度呈劑量反應關系。

致謝:感謝四川大學康啟智和陜西師范大學生命科學學院楊瑾博士的幫助和支持。

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