非線性電化學(xué)指紋圖譜技術(shù)鑒別羊奶和牛奶及其產(chǎn)地

魯利利，董文賓，張?zhí)┿?，張娟，王二丹，許天舒

1(中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長沙，410083)2(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安，712081)

羊奶有“貴族奶品”之稱，在歐美等發(fā)達(dá)國家稱之為“奶中之王”。其價格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于牛奶，而且供不應(yīng)求，故市場上以牛奶冒充羊奶的現(xiàn)象時有發(fā)生。此外，來自不同產(chǎn)地的同種原奶，因相關(guān)飼養(yǎng)條件和環(huán)境等因素不同，導(dǎo)致其質(zhì)量之間存在差異。故需提出一種切實可行的鑒別羊奶和牛奶及其產(chǎn)地的方法。

色譜技術(shù)是鑒別食品用得最多的方法，而且主要靠其成分測定指標(biāo)來判斷食品真?zhèn)危?］。作為食品重要的組成部分，牛奶和羊奶的鑒別方法則鮮有報道。目前主要根據(jù)羊奶和牛奶中蛋白質(zhì)的不同，通過檢測蛋白質(zhì)含量的變化來進(jìn)行判斷［2］，鑒別分析的準(zhǔn)確度不高。因此，不利用表征樣品成分群集整體信息的指紋圖譜技術(shù)，僅憑若干成分測定指標(biāo)來鑒別羊奶和牛奶，難以保證結(jié)果的可靠。盡管目前的指紋圖譜技術(shù)中有色譜、光譜和分子生物學(xué)技術(shù)等，但將這些指紋圖譜技術(shù)成功用于奶品種類和產(chǎn)地的鑒別還未見報道。非線性電化學(xué)指紋圖譜技術(shù)［3－4］的提出，為鑒別奶品的種類和產(chǎn)地提供了方便。

非線性電化學(xué)指紋圖譜是一種建立在非線性化學(xué)原理之上的動力學(xué)指紋圖譜。化學(xué)湍流和化學(xué)振蕩等非線性化學(xué)反應(yīng)都可用來建立非線性電化學(xué)指紋圖譜。盡管非線性化學(xué)反應(yīng)，尤其是化學(xué)振蕩反應(yīng)，國內(nèi)外學(xué)者對其反應(yīng)機理和應(yīng)用已進(jìn)行了較廣泛和深入的研究［5－10］，但發(fā)現(xiàn)它可用于指紋圖譜技術(shù)，本世紀(jì)初才開始。然而，非線性電化學(xué)指紋圖譜技術(shù)的理論、方法、功能、特點、影響因素、檢測條件、模式識別、檢測儀器和應(yīng)用等方面的系統(tǒng)研究成果［3－4，11－14］卻推動了這一指紋圖譜技術(shù)研究和應(yīng)用的快速發(fā)展［15－28］。本文利用非線性電化學(xué)指紋圖譜技術(shù)成功鑒別了羊奶、牛奶及其產(chǎn)地，也為其他種類奶品鑒別方法的研究提供了思路。

1 材料與方法

1.1 試劑、樣品和儀器

試劑:1.00 mol/L H2SO4、1.00 mol/L 丙酮、0.800 mol/L NaBrO3、0.080 0 mol/L硫酸錳和0.015 0 mol/L NaBr溶液。試劑均為分析純，采用二次蒸餾水。

樣品:不同時間和不同產(chǎn)地采集的鮮牛奶1#、2#、3#和 4#，以及鮮羊奶 1#、2#、3#、4#和 5#干燥粉末(以下簡稱樣品為牛奶或羊奶)。

儀器:非線性化學(xué)指紋圖譜智能分析儀(MZ－1A型，湖南尚泰測控科技有限公司生產(chǎn))。

1.2 實驗方法

準(zhǔn)確稱取0.987 0 g樣品奶粉末、量取1.00 mol/LH2SO425.00 mL、1.00 mol/L 丙酮 10.00 mL、0.080 0 mol/L硫酸錳12.00 mL和0.0150 mol/L NaBr溶液3.00 mL，以及3.00 mL蒸餾水于反應(yīng)器中，蓋好帶注射孔和電極的反應(yīng)器蓋。開啟恒溫系統(tǒng)調(diào)節(jié)反應(yīng)器溫度為50.0℃、設(shè)定850 r/min恒速攪拌，點擊菜單采集數(shù)據(jù)，攪拌到5.0 min時用注射器迅速加入0.800 mol/L NaBrO3溶液5.00 mL。記錄E-t曲線至電位E不再隨時間t變化為止。

2 結(jié)果與討論

2.1 指紋圖譜檢測用量的選擇

與其他指紋圖譜一樣，非線性電化學(xué)指紋圖譜對測定條件變化也很敏感。測定非線性電化學(xué)指紋圖譜時，不同檢測用量會使一定體積的反應(yīng)體系中樣品成分的濃度發(fā)生變化。根據(jù)非線性化學(xué)指紋圖譜的動力學(xué)性質(zhì)，樣品成分的濃度變化不僅會影響非線性化學(xué)反應(yīng)的速度，也可能導(dǎo)致反應(yīng)機理的變化，表現(xiàn)為指紋圖譜定量信息發(fā)生變化，也可能出現(xiàn)指紋圖譜特征的明顯改變［12－13］。實驗表明，當(dāng)檢測用量太小時，因體系中由樣品提供的反應(yīng)底物濃度太小，不足以引起非線性化學(xué)反應(yīng);當(dāng)檢測用量太大時，雖然樣品提供的底物濃度很大，但由樣品帶來的對非線性化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生干擾和抑制作用的其他共存物的濃度也很大，這時對非線性化學(xué)反應(yīng)的干擾和抑制作用成為矛盾的主要方面，最終使非線性化學(xué)反應(yīng)也無法進(jìn)行。這2種情況都無法測定指紋圖譜。因此，必須在合適的檢測用量范圍內(nèi)才能測得指紋圖譜。選擇檢測用量的原則是，指紋圖譜既有較好的特征和較豐富的信息，又能在盡可能短的時間內(nèi)完成測定。本文按1.2方法測定了各種樣品奶粉末的檢測用量對其指紋圖譜的影響。結(jié)果表明，在0.4230～1.412g內(nèi)各種樣品奶指紋圖譜特征信息受檢測用量影響的規(guī)律類似。圖1表示了羊奶1指紋圖譜的特征受檢測用量影響的規(guī)律。由圖1可測定樣品奶指紋圖譜時，其檢測用量為0.9870g左右較合適。實驗選用0.987 0 g。

圖1 檢測用量對羊奶1非線性電化學(xué)指紋圖譜的影響.1－0.423 0g;2－0.564 1g;3－0.845 9g;4－0.987 0g;5－1.269g;6－1.412g.Fig.1 Influence of determining dosage on the nonlinear electrochemical fingerprint of goat’s milk 1.1－0.423 0g;2－0.564 1g;3－0.845 9g;4－0.987 0g;5－1.269g;6－1.412g.

2.2 奶品非線性電化學(xué)指紋圖譜及其基本信息

奶品非線性電化學(xué)指紋圖譜中含有許多直觀信息和可量化信息，即特征參數(shù)［12］。其直觀信息中包含誘導(dǎo)曲線、波動曲線、波峰形狀和停波曲線等，而特征參數(shù)中包含峰谷電位(Ecan)、峰谷時間(tcan)、峰頂電位(Epet)、峰頂時間(tpet)、誘導(dǎo)時間(tind)、起波電位(Euns)、停波電位(Eune)、停波時間(tune)、平衡電位(Eequ)、平衡時間(tequ)、波動幅度(ΔEund)、最大波幅(ΔEmax)、波動壽命(tund)、波動周期(τund)和波數(shù)(nwav)等。如牛奶1#非線性化學(xué)指紋圖譜的一些基本特征信息見圖2。這些特征信息參數(shù)對用系統(tǒng)相似度模式識別奶品及其產(chǎn)地非常有用。各奶品指紋圖譜特征參數(shù)的平均值列于表1，可作為相應(yīng)指紋圖譜共有模式的參數(shù)特征值。

圖2 牛奶1非線性電化學(xué)指紋圖譜的部分基本特征信息e－f:誘導(dǎo)曲線;f－g:波動曲線;g－h(huán):停波曲線;e和h分別為非線性化學(xué)反應(yīng)的起點和終點Fig.2 Some basic characteristic information in nonlinear electrochemical fingerprint of cow’s milk 1.e－f:inductive curve;f－g:undulatory curve;g－h(huán):wave－end curve;e and h are the start and end points of the nonlinear chemical reaction，respectively.

2.3 利用指紋圖譜直觀特征鑒別奶品種類

表1 各奶品非線性電化學(xué)指紋圖譜的參數(shù)特征值(樣品平行測定3次，取其參數(shù)特征值的平均值;a、b和數(shù)字分別代表牛奶和羊奶及其產(chǎn)地編號，下同)*Table 1 Parametric eigenvalues in nonlinear electrochemical fingerprints of each milk sample(the average values of the parametric eigenvalues in the fingerprints obtained by 3 parallel determinations;a，b and digitals are cow’s milk，goat’s milk and their origin numbers，the same as below)*

圖3 牛奶 1#、2#、3#、4#(a)和羊奶 1#、2#、3#、4#、5#(b)的非線性電化學(xué)指紋圖譜Fig.3 Nonlinear electrochemical fingerprints of cow’s milks 1，2，3，4(a)and goat’s milks 1，2，3，4，5(b).

圖4 牛奶1#和4#(a、b)及羊奶1#和5#(c、d)非線性電化學(xué)指紋圖譜的特征差異Fig.4 The characteristic differences between nonlinear electrochemical fingerprints of cow’s milks 1 as well as 4(a，b)and those of goat’s milks 1 as well as 5(c，d)

非線性化學(xué)指紋圖譜有很強的特征性，不同品種的樣品都有各自不同的圖譜。如圖3所示，樣品奶非線性化學(xué)指紋圖譜具有很好的特征性。不同奶品因其成分的種類和濃度差異，其指紋圖譜也表現(xiàn)出相應(yīng)的差異。奶品成分及其濃度的差異越大，其指紋圖譜的特征差異就越大;反之，成分及其濃度差異越小，相應(yīng)指紋圖譜的特征差異就越小。由圖3可見，牛奶、羊奶均有其各自的特征圖譜，無論是誘導(dǎo)時間，還是圖譜的基本輪廓都有較大的差異。如羊奶指紋圖譜的誘導(dǎo)時間較長、波動幅度較小、波動曲線輪廓的前部分明顯向下凹陷等，這些都是不同產(chǎn)地和不同時間采集的羊奶指紋圖譜的共同特征;與此相反，牛奶指紋圖譜的誘導(dǎo)時間較短、波動幅度較大、波動曲線輪廓的前部分沒有向下凹陷的現(xiàn)象等，這些都是不同產(chǎn)地和不同時間采集的牛奶指紋圖譜的共同特征。圖3中指紋圖譜表明，牛奶和羊奶屬于不同的奶品，因其成分差異較大，故特征差異非常明顯。僅利用羊奶和牛奶指紋圖譜共同特征之間這些顯著差異，便可快速和準(zhǔn)確地將它們區(qū)別開來，就像利用直觀特征區(qū)別新鮮水果或蔬菜的種類那樣容易。例如，僅根據(jù)牛奶1#和4#及羊奶1#和5#非線性化學(xué)指紋圖譜明顯的直觀特征差異(圖4)就可準(zhǔn)確鑒別其是牛奶還是羊奶，很難出錯。

2.4 奶品指紋圖譜的重現(xiàn)性

奶品非線性化學(xué)指紋圖也有很好的重線性。無論牛奶或羊奶，同種同產(chǎn)地奶品的指紋圖譜均具有很高的相似度(表2)，圖5表明了牛奶1#和4#，以及羊奶1#和5#非線性化學(xué)指紋圖譜的重現(xiàn)性。這種良好的重現(xiàn)性也是利用指紋圖譜鑒別奶品的必要條件。

2.5 用模式識別方法鑒別奶品種類和產(chǎn)地

不同產(chǎn)地的同種奶品(牛奶或羊奶)，因其成分的種類相近，主要只是成分相對含量有所差異，因而其指紋圖譜的直觀特征差異不很明顯，這時可利用模式識別方法來進(jìn)行鑒別產(chǎn)地。

圖5 牛奶1#和4#(a、b)及羊奶1#和5#(c、d)非線性電化學(xué)指紋圖譜的重現(xiàn)性和特征差異Fig.5 Reproducibility and characteristic difference of nonlinear electrochemical fingerprints of cow’s milks 1 and 4(a，b)and goat’s milks 1 and 5(c，d).

2.5.1 模式識別方法選擇

模式識別方法很多，但研究最多的指紋圖譜常用模式識別方法可分為兩大類。一類是聚類模式識別，如族類模式識別(CA)和主成分分析模式識別(PCA)法;另一類則是系數(shù)模式識別，包括距離系數(shù)和相似度系數(shù)模式識別法，如歐氏距離、馬氏距離、相關(guān)系數(shù)、夾角余弦和系統(tǒng)相似度等。聚類模式識別主要是從指紋圖譜中提取其潛在而規(guī)律性的特征差異，將這種潛在差異轉(zhuǎn)變成最終可通過人眼識別的直觀圖譜，如CA模式識別得到的樹結(jié)構(gòu)圖和PCA模式識別得到的特征點分布圖等。系數(shù)模式識別則是利用判別函數(shù)模型對原始實驗數(shù)據(jù)處理的值(距離或相似度)根據(jù)判別標(biāo)準(zhǔn)(臨界距離或臨界相似度)來鑒別樣品的種類、真?zhèn)位虍a(chǎn)地等。系數(shù)模式識別一般還具有相對定量評價的特點。

如文獻(xiàn)［13］所述，在幾種常用的系數(shù)模式識別法中，系統(tǒng)相似度最能真實地反映指紋圖譜，尤其是非線性化學(xué)指紋圖譜之間特征差異的相對大小。本文利用系統(tǒng)相似度模式鑒別奶品的產(chǎn)地。

2.5.2 利用系統(tǒng)相似度模式鑒別奶品種類和產(chǎn)地

適用于非線性化學(xué)指紋圖譜模式識別的系統(tǒng)相似度是一種參數(shù)型相似度，該相似度系數(shù)的計算模型為:

式中各符號的物理意義已在文獻(xiàn)［13］中進(jìn)行了詳細(xì)介紹。

本文以表1中各奶品指紋圖譜參數(shù)特征值的平均值作為其指紋圖譜的共有模式參數(shù)特征值。利用各產(chǎn)地奶品測得的指紋圖譜參數(shù)特征值，分別以各種共有模式參數(shù)特征值為參照，通過式(1)計算指紋圖譜的系統(tǒng)相似度(表2)。由表2可見，同種同產(chǎn)地奶品指紋圖譜的系統(tǒng)相似度在99.06%～99.86%之間，同種但不同產(chǎn)地奶品的系統(tǒng)相似度在90.42% ～98.86%之間，不同種奶品的系統(tǒng)相似度在76.25%～82.43%之間。由表2中數(shù)據(jù)和圖3中指紋圖譜可知，系統(tǒng)相似度與指紋圖譜直觀特征差異程度相一致，而這種差異程度決定于樣品中成分的種類及其含量。因此，若以臨界系統(tǒng)相似度Qc=(0.988 6+0.990 6)/2=0.989 6作為鑒別奶品產(chǎn)地的判據(jù)，即指紋圖譜系統(tǒng)相似度＞98.96%時屬同一產(chǎn)地，≤98.96%時則不是同一產(chǎn)地，這將獲得很高的鑒別準(zhǔn)確度。對4個產(chǎn)地的牛奶和5個產(chǎn)地的羊奶各取37個樣品測定指紋圖譜，采用系統(tǒng)相似度模式對其品種和產(chǎn)地進(jìn)行了識別驗證(表3)。結(jié)果表明，系統(tǒng)相似度模式鑒別奶品產(chǎn)地的準(zhǔn)確度≥91.9%，其平均準(zhǔn)確度達(dá)到94.3%;鑒別奶品種類的準(zhǔn)確度≥94.6%，其平均準(zhǔn)確度達(dá)到98.5%。還存在較低誤判率的主要原因可能是部分奶品在測定時已放置了相對較長時間，其成分已發(fā)生較大變化。如果在求各品種和產(chǎn)地奶品指紋圖譜的共有模式特征參數(shù)時，如果增加各品種和產(chǎn)地訓(xùn)練樣本的數(shù)目，用系統(tǒng)相似度鑒別奶品種類和產(chǎn)地的準(zhǔn)確度會更高。

表2 以各奶品指紋圖譜共有模式參數(shù)特征值為參照計算的奶品指紋圖譜系統(tǒng)相似度(均測定3個批次樣品)Table 2 The system similarities obtained by taking the parametric eigenvalues of fingerprint common mode of each milk as reference criterion(three batches of samples were determined for each milk)

表3 利用系統(tǒng)相似度模式鑒別奶品種類和產(chǎn)地的結(jié)果Table 3 The results to identify the type and origin of milk products by system similarity pattern

3 結(jié)論

本研究利用非線性電化學(xué)指紋圖譜技術(shù)鑒別羊奶、牛奶及其產(chǎn)地，結(jié)果表明羊奶和牛奶非線性電化學(xué)指紋圖譜均有很好的重現(xiàn)性和特征性，利用其直觀特征就可準(zhǔn)確鑒別羊奶和牛奶;不同產(chǎn)地的羊奶或牛奶可利用系統(tǒng)相似度模式識別，用系統(tǒng)相似度模式鑒別奶品產(chǎn)地的準(zhǔn)確度≥91.9%，其平均準(zhǔn)確度達(dá)到94.3%;鑒別奶品種類的準(zhǔn)確度≥94.6%，其平均準(zhǔn)確度達(dá)到98.5%。這表明非線性電化學(xué)指紋圖譜技術(shù)能較準(zhǔn)確地鑒別奶品的種類和產(chǎn)地。本工作為奶品的種類和產(chǎn)地鑒別提供了一種簡便易行和準(zhǔn)確可靠的方法。

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