巨噬細(xì)胞極化介導(dǎo)閉塞性細(xì)支氣管炎發(fā)生的機制研究

劉 杰，王建剛，孟慶姝，李 靜，范慧敏，，周曉慧

(1.同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院心外科，上海 200120;2.同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院心力衰竭研究所，上海 200120)

肺移植是延長終末期肺病患者生存時間的唯一有效方法。肺移植術(shù)后面臨的最大問題是閉塞性細(xì)支氣管炎(obliterative bronchiolitis，OB)或者細(xì)支氣管炎綜合征(bronchiolitis obliterans syndrome，BOS)。OB是肺移植術(shù)后患者存活率低的主要原因，肺移植術(shù)后5年OB的發(fā)生率可達49%，術(shù)后10年則高達75%［1-2］。最近的研究認(rèn)為，肺移植術(shù)后固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)被激活，其相互作用導(dǎo)致長期持續(xù)的慢性炎癥反應(yīng)是形成OB的根本原因。巨噬細(xì)胞是參與機體固有免疫反應(yīng)的重要成分，研究［3］發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在OB的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。IL-17是介導(dǎo)固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。IL-17主要由新發(fā)現(xiàn)的Th17細(xì)胞亞群產(chǎn)生，gamma-delta T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞也可產(chǎn)生IL-17。已經(jīng)證實Th17細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-17參與多種自身免疫性疾病、炎癥和移植排斥的發(fā)生和發(fā)展［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)肺移植術(shù)后患者如出現(xiàn)急性排斥(OB的起始危險因素)，則其支氣管肺泡灌洗液中IL-17蛋白及mRNA表達水平明顯升高，且升高程度與急性排斥反應(yīng)的嚴(yán)重程度密切相關(guān)［6］，后續(xù)研究證實IL-23/IL-17軸促進肺移植后OB的發(fā)生［7］。根據(jù)以上研究基礎(chǔ)，本實驗就OB不同階段巨噬細(xì)胞的分化，以及IL-17在其中的作用進行探討，對OB發(fā)生機制進行深入的研究，為理解OB的發(fā)生機制，提高移植患者的生存質(zhì)量，延長生存期提供重要的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級 C57BL/6，雄性，20只;BALB/c，雄性，10只，體質(zhì)量20～25 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司［許可證號SCXK(滬)2007-0005］;IL-17基因敲除C57BL/6小鼠，雄性，10只，受贈于美國MD Anderson腫瘤中心董晨教授。小鼠飼養(yǎng)于同濟大學(xué)實驗動物中心，SPF級動物房。所有實驗操作按照同濟大學(xué)實驗動物操作指南進行。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉粉劑購自美國Sigma公司;硫酸阿托品注射液購自上海和豐有限公司;RPMI 1640(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺)購自美國Gibco公司;熒光標(biāo)記的抗小鼠 CD14，抗小鼠 CD80，購自美國 BD Pharmingen公司;紅細(xì)胞裂解液購自美國R＆D公司;Elisa試劑盒(431307)購自美國 BioLegend公司。

眼科手術(shù)顯微鏡(SM-2000L)購自上海軼德醫(yī)療設(shè)備有限公司;MPA生物信號采集分析系統(tǒng)購自上海奧爾科特生物有限公司;顯微外科手術(shù)器械購自蘇州醫(yī)療器械廠;4-0和9-0尼龍縫線購自上海精儀醫(yī)療器械廠;流式細(xì)胞儀為美國 BD公司FACScalibur。

1.3 動物分組及模型建立

20～25 g清潔級的 C57BL/6，雄性，20只;IL-17基因敲除 C57BL/6，雄性，10只;BALB/c雄性，10只，按體質(zhì)量隨機配對分為三組。實驗組A為正常C57BL/6(n=10)無手術(shù)對照組;實驗組B為BALB/c(n=5)→C57BL/6(n=10)組;實驗組C為BALB/c(n=5)→IL-17基因敲除C57BL/6(n=10)組。建立小鼠原位氣管移植，即供體小鼠麻醉后正中頸部切口，取出10個氣管環(huán)分為兩段，采用端端吻合技術(shù)分別植入到兩只受體小鼠。術(shù)后注意保暖。

1.4 組織病理學(xué)

分離、切除移植氣管，固定于10%中性甲醛溶液，常規(guī)石蠟包埋，制成3 μm厚切片，行H-E染色，觀察切片。(1)移植氣管內(nèi)膜變化:觀察內(nèi)膜水腫程度，纖毛柱狀上皮細(xì)胞生長和纖維組織增生情況;(2)移植氣管炎癥細(xì)胞浸潤情況:觀察炎癥細(xì)胞浸潤程度和細(xì)胞類型;(3)計算管腔閉塞情況:首先描出氣管軟骨內(nèi)表面的輪廓，首尾相連，代表氣管內(nèi)膜線，然后描出氣管實際剩余內(nèi)腔面的曲線，計算二者近似面積，閉塞程度(%)=(軟骨環(huán)內(nèi)面積－實際剩余管腔面積)/軟骨環(huán)內(nèi)面積。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測

研磨脾臟，收集細(xì)胞后首先進行表面標(biāo)志染色，即100 μl PBS重懸細(xì)胞，加入 FITC-ANTI-CD14，PE-ANTI-CD86染色，避光4℃孵育30 min，PBS洗2次。然后300 μl PBS重懸后用流式細(xì)胞儀進行檢測。數(shù)據(jù)用Cell Quest軟件(BD Bioscience)分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所得所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包處理。數(shù)據(jù)以x±s表示，采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組總體效果評價

在各組標(biāo)本采集前，小鼠均存活。移植后實驗組小鼠精神狀態(tài)較正常對照小鼠差，但進食、活動均無異常，亦無感染。

2.2 小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞的表型檢測

流式細(xì)胞儀檢查未接受氣管移植的正常對照組、IL-17基因敲除組(BALB/c→IL-17基因敲除C57BL/6)小鼠脾臟巨噬細(xì)胞的表型，流式細(xì)胞儀檢測實驗組(BALB/c→C57BL/6)接受氣管移植后7 d脾臟中單核巨噬細(xì)胞表面CD14和CD86的表達水平。結(jié)果顯示，接受氣管移植的小鼠中，M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記CD86隨移植后時間的延長，逐漸下調(diào)(圖1)，提示巨噬細(xì)胞的極化方向與OB的進程密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞M1方向的極化主要發(fā)生于移植后早期(7 d)并介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)。與正常對照組相比，IL-17基因敲除明顯下調(diào)巨噬細(xì)胞表面CD86的表達水平(圖2)。

圖1 BALB/c→C57BL/6移植后不同時間點巨噬細(xì)胞表型的檢測Fig.1 Phenotype of spleen macrophages at different time points after transplantation

圖2 正常對照組以及實驗組移植后7 d巨噬細(xì)胞表型的改變Fig.2 Phenotype of spleen macrophages on 7th day after transplantation in control and experimental group

2.3 術(shù)后各組小鼠病理組織學(xué)檢測

氣管移植術(shù)后14、30 d取移植物進行病理學(xué)檢測。與正常對照組相比，移植后7 d，異系移植組氣管內(nèi)膜嚴(yán)重水腫，內(nèi)膜無纖毛柱狀上皮細(xì)胞生長，無纖維組織增生，可見內(nèi)膜有大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤。術(shù)后30 d，水腫消退，氣管內(nèi)膜以淋巴細(xì)胞浸潤為主，基質(zhì)沉積、纖維增生致管腔狹窄(圖3)。各組管腔的閉塞程度:對照組 10% ±2.4%，BALB/c→C57BL/6 組52% ±7.4%，BALB/c→IL-17基因敲除26% ±3.8%，組間相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。BALB/c→C57BL/6組較對照組管腔明顯狹窄，BALB/c→IL-17基因敲除組較BALB/c→C57BL/6組管腔狹窄明顯減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。

圖3 氣管移植物H-E染色結(jié)果Fig.3 H-E staining of representative graft sections(×100)

3 討 論

國際心肺移植協(xié)會2011年數(shù)據(jù)顯示，肺移植后5年存活率為53%，10年存活率為30%［1］。OB是肺移植術(shù)后患者存活率低的主要原因。近年發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞的浸潤程度與移植后急性排斥反應(yīng)高低明顯相關(guān)。大鼠肺移植急性排斥期可見大量巨噬細(xì)胞浸潤，可增加至正常狀態(tài)時的25倍［8］。巨噬細(xì)胞極化是近年來提出的一個復(fù)雜概念，包括經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(classical activated macrophage，M1型)和替代激活的巨噬細(xì)胞(altern-ative activated macrophage，M2型)兩型［9-10］。M1 型細(xì)胞產(chǎn)生大量促炎癥因子，如 TNFα、IL-1β、IL-6等，同時，本身作為參與免疫應(yīng)答的效應(yīng)細(xì)胞，促進炎癥反應(yīng)。M2型細(xì)胞與M1型不同，其功能表現(xiàn)為抑制炎癥反應(yīng)，參與肉芽腫的形成，最終達到組織修復(fù)的目的。本研究發(fā)現(xiàn)，移植后不同時相巨噬細(xì)胞的表型不同，移植后初期(7 d)，巨噬細(xì)胞CD86的表達水平明顯高于移植后14、30 d。前期的研究也發(fā)現(xiàn)，M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)的炎癥因子IL-6在移植后7 d明顯升高，提示除了巨噬細(xì)胞數(shù)量的改變外，其不同的極化狀態(tài)與移植排斥的發(fā)生密切相關(guān)。

IL-17是介導(dǎo)固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。IL-17自1995年被發(fā)現(xiàn)以來，其在誘導(dǎo)炎癥方面的強大功能越來越被重視。已經(jīng)證實Th17細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-17參與多種自身免疫性疾病、炎癥和移植排斥的發(fā)生和發(fā)展。研究［7］發(fā)現(xiàn)，肺移植術(shù)后患者如出現(xiàn)急性排斥，其支氣管肺泡灌洗液中IL-17蛋白及mRNA表達水平明顯升高，且升高程度與急性排斥反應(yīng)的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，后續(xù)研究證實IL-23/IL-17軸促進肺移植后OB的發(fā)生。肺移植術(shù)后發(fā)生OB的小鼠血清或脾臟中IL-17A蛋白或mRNA的表達水平較未發(fā)生OB組顯著上升，采用IL-17受體融合蛋白阻斷IL-17與其受體結(jié)合能夠降低急性排斥反應(yīng)，抑制肺組織纖維化，減輕OB 的病理改變［11］。研究［12］發(fā)現(xiàn)，抗 IL-23 抗體能阻斷Th17存活的重要細(xì)胞因子IL-23，降低體內(nèi)IL-17的水平，并減輕OB的病理改變。因此，IL-17可能是促進肺移植術(shù)后OB發(fā)生的關(guān)鍵因素。但IL-17促進OB發(fā)生的機制研究尚處于探索階段，深入研究IL-17介導(dǎo)OB發(fā)生的機制可能有利于發(fā)現(xiàn)新的靶點來治療和預(yù)防OB。

有關(guān)狼瘡性腎炎的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞極化與IL-17下游信號分子 ERK的激活有關(guān)［13］。Basha等［14］發(fā)現(xiàn)IL-17敲除小鼠在支氣管內(nèi)給予抗MHCI后，CD4陽性 T細(xì)胞較野生型小鼠減少36.8% ，CD11b陽性的巨噬細(xì)胞則減少62.7%。但是，IL-17是否調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化過程，目前尚不清楚。

在移植肺，巨噬細(xì)胞表達TLRs，通過病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)識別病原體成分(LPS等)，以及表達DDRs等受體通過損傷相關(guān)的分子模式(damage assciated molecular pattern，DAMP)識別機體自身暴露的因子(如膠原等)，激活固有免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。激活的DC、巨噬細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞能提呈同種異體抗原，激活T細(xì)胞免疫介導(dǎo)排斥反應(yīng)，另外，巨噬細(xì)胞激活固有免疫介導(dǎo)的炎癥環(huán)境能促進效應(yīng)性T細(xì)胞亞群分化，產(chǎn)生促炎因子，進一步加重炎癥。因此，巨噬細(xì)胞是OB進程的關(guān)鍵因素，在介導(dǎo)固有免疫與適應(yīng)性免疫反應(yīng)以及兩者相互作用方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。因此，抑制巨噬細(xì)胞分化及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，維持固有免疫與適應(yīng)性免疫反應(yīng)平衡，可能成為有效干預(yù)OB的重要方法。本研究表明，IL-17基因敲除明顯下調(diào)氣管移植后小鼠脾臟中CD14/CD86雙陽性M1型巨噬細(xì)胞的水平，且IL-17基因敲除組病理改變明顯較野生型減輕，提示IL-17可能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的極化過程并影響OB的進程。對該調(diào)節(jié)作用更為精準(zhǔn)的闡明以及對OB發(fā)生機制的深入研究可能為OB防治開啟新的希望。

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