瘦素基因敲除肥胖大鼠的血糖及病理長期觀察

張 麗，關(guān)菲菲，張 旭，陳 煒，孫彩顯，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021）

瘦素基因敲除肥胖大鼠的血糖及病理長期觀察

張 麗，關(guān)菲菲，張 旭，陳 煒，孫彩顯，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021）

目的 對Leptin基因敲除SD大鼠血糖變化及病理表型進(jìn)行長期分析，為使用該大鼠作為糖尿病和脂代謝模型積累數(shù)據(jù)。方法 western blot檢測Leptin+/+大鼠和Leptin-/-大鼠肝臟中Leptin的表達(dá)。利用稱量方法測定Leptin基因敲除的SD大鼠（Leptin-/-）1，3，6，8月齡的體重變化，利用穩(wěn)豪血糖儀采尾血測定1，3，6，8月齡Leptin-/-大鼠空腹血糖值。HE染色和免疫組織化學(xué)觀察Leptin-/-大鼠胰腺及肝臟的病理學(xué)變化。結(jié)果 Leptin-/-大鼠肝臟中表達(dá)變短的功能異常的Leptin蛋白。Leptin-/-大鼠從1月齡開始出現(xiàn)顯著的體重增加，8月齡時雌性體重為884 g，雄性體重可以達(dá)到1200 g，是野生SD大鼠的2倍。自1月齡起，Leptin-/-雌鼠的空腹血糖值顯著高于野生大鼠，在1月齡到6月齡之間差別明顯（40％～26％），到8月齡和野生大鼠恢復(fù)到近正常水平。8月齡Leptin-/-大鼠肝臟肝小葉中出現(xiàn)大量脂肪空泡，胰腺內(nèi)較多脂肪細(xì)胞浸潤、胰島數(shù)量明顯增多，體積增大，胰島素陽性β細(xì)胞增多。結(jié)論 Leptin-/-大鼠表型表現(xiàn)為肥胖，脂肪肝，胰島增生和早期高血糖。

瘦素；基因敲除；空腹血糖；肥胖；大鼠

瘦素（Leptin）是一個主要由白色脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)類激素［1］，其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的瘦素受體結(jié)合能夠啟動調(diào)節(jié)攝食和機(jī)體能量平衡，當(dāng)瘦素缺失或者受體缺失，會導(dǎo)致肥胖發(fā)生［2］。

美國杰克遜實驗室發(fā)現(xiàn)的一種隱性遺傳的Leptin自發(fā)突變小鼠（ob/ob）［3］，表現(xiàn)為攝食過度、肥胖、葡萄糖耐受、高血漿胰島素水平、不孕不育，因此被廣泛地應(yīng)用于糖尿病、肥胖、心血管和代謝類疾病研究［4］。

盡管大鼠是使用量僅次于小鼠的實驗動物，而且相對于小鼠，大鼠與人類的關(guān)系近了大約400～500萬年［5］，其在生理、代謝、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面比小鼠有更好的表現(xiàn)［6］。然而，傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)受到大鼠的ES細(xì)胞全能性局限，而一度未能實現(xiàn)Leptin敲除大鼠的建立。隨著鋅指酶（ZFN）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)因子核酸酶（TALENs）等技術(shù)的不斷完善，使大鼠基因敲除實用化［7-9］。2012年，Serglo Valra等［10］利用ZFN技術(shù)獲得了一種Leptin敲除大鼠，是在該基因外顯子1和內(nèi)含子上發(fā)生了151個堿基片斷的缺失，Leptin蛋白無法正常表達(dá)。該純合子大鼠出現(xiàn)攝食增加，肥胖，血清中總膽固醇、高密度和低密度膽固醇顯著增加，有明顯的高胰島素血和糖耐受受損。

我們利用TALENs技術(shù)建立了Leptin基因敲除的SD大鼠品系（Leptin-/-），并對年輕 Leptin -/-大鼠的體重、脂肪含量、糖代謝等進(jìn)行了初步分析報，發(fā)現(xiàn)4月齡的Leptin-/-大鼠已經(jīng)表現(xiàn)出肥胖、高胰島素血、高脂血和糖代謝異常［11］。雖然目前世界上幾個實驗室建立了Leptin-/-大鼠，但是一方面敲除的區(qū)域不同［10-11］，另一方面，缺少對Leptin-/-大鼠長期病理生理變化的分析數(shù)據(jù)，影響了Leptin-/-大鼠的作為肥胖、糖尿病等疾病模型的使用。本文對1～8月齡Leptin-/-大鼠及同窩瘦大鼠（Leptin+/+）的血糖變化及病理表型進(jìn)行了對比分析，為Leptin-/-大鼠作為肥胖、糖尿病等模型提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物

Leptin-/-大鼠背景品系為SD，在本實驗室繁育（SCXK（京）2013-002），選擇基因敲除純合子Leptin-/-大鼠和同窩陰性大鼠（Leptin+/+）。雌鼠：Leptin+/+（n=5）和 Leptin-/-（n=5）各5只；雄鼠：Leptin+/+4只（n=4）和 Leptin -/-2只（n=2）。本實驗方案得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為ILAS-GC-2012-001。

1.2 western blot檢測Leptin的表達(dá)

提取Leptin-/-大鼠和同窩陰性Leptin+/+大鼠肝組織總蛋白，BCA法測定濃度，進(jìn)行 SDSPAGE凝膠電泳，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到0.45μm硝酸纖維素膜上，置于5％的脫脂奶粉封閉液中，室溫1 h，加入TBST稀釋的兔抗Leptin多克隆抗體（1：500）（ab117751，Abcam，美國），4°C孵育過夜，用TBST洗膜三次，每次10 min。然后加入1：15000辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫雜交1 h。采用HRP-GAPDH（康成生物，中國）作為內(nèi)參，將膜置于化學(xué)發(fā)光劑中，用X光膠片曝光、顯影及定影。

1.3 體重測定

從1月齡開始，分別于1、3、6、8月齡給待測大鼠稱重。

1.4 空腹血糖測定

分別于1、3、6、8月齡，待測大鼠禁食過夜（不禁水），次日上午八點采尾血穩(wěn)豪血糖儀測定血糖值。

1.5 組織學(xué)觀察

2％戊巴比妥鈉麻醉犧牲大鼠，打開腹腔取出胰腺及肝臟固定于10％中性福爾馬林中24 h，脫水，石蠟包埋及切片HE染色，抗胰島素（insulin）多克隆抗體行免疫組織化學(xué)（4590s，1：100，Cell signaling），切片用Scanscope病理切片掃描器（美國Aperio公司）掃描后觀察病理學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Student’s t-tests分析處理數(shù)據(jù)，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 Leptin-/-大鼠表現(xiàn)肥胖表型

為了對Leptin-/-大鼠的肥胖水平進(jìn)行檢測，從出生后1月齡始至8月齡，測定Leptin+/+和Leptin-/-大鼠的體重，6月齡Leptin+/+大鼠和Leptin-/-大鼠體型比較（圖1A）。Western blot結(jié)果顯示，8月齡Leptin-/-大鼠肝臟中不表達(dá)正常的Leptin蛋白，Lepin由于C末端缺失了28個氨基酸［11］分子量變?。▓D1B）。從1月齡開始出現(xiàn)顯著的體重增加，1月齡Leptin-/-雌、雄鼠體重比同窩瘦大鼠（Leptin+/+）分別增加了27％和37％，到3月齡時 Leptin-/-雌、雄鼠體重比同窩瘦大鼠（Leptin+/+）增加了38％和39％，6月齡、8月齡時Leptin-/-雌鼠體重是同窩瘦大鼠（Leptin+/+）的2.3倍，6月齡、8月齡時Leptin-/-雄鼠的體重是同窩瘦大鼠（Leptin+/+）的1.8倍和2.0倍（圖1C和圖1D）。

2.2 Leptin-/-大鼠空腹血糖值增高

從出生后1月齡始至8月齡，測定Leptin+/+雌鼠和Leptin-/-雌鼠的空腹血糖值。Leptin-/-大鼠空腹血糖表現(xiàn)出隨月齡的變化（圖2），雌鼠自1月齡起，Leptin-/-大鼠的空腹血糖值就顯著高于Leptin+/+大鼠（40％），3月齡比Leptin+/+大鼠高33％，6月齡血糖降低但仍然比Leptin+/+大鼠高26％，8月齡時比野生大鼠高出11％，高血糖表型可以維持5個月以上。

2.3 Leptin-/-大鼠肝臟病理

取材4、8月齡雌性Leptin-/-大鼠及Leptin +/+大鼠肝臟固定，石蠟包埋及切片，HE染色觀察Leptin-/-大鼠肝臟病理學(xué)變化（彩插7圖3）。結(jié)果顯示，4月齡Leptin-/-大鼠與Leptin+/+大鼠相比，沒有明顯的病理變化，8月齡 Leptin-/-大鼠肝臟肝小葉中出現(xiàn)大量脂肪空泡，提示肝細(xì)胞脂肪變性。

2.4 Leptin-/-大鼠胰島增生

圖1 Leptin-/-大鼠表現(xiàn)肥胖Note：A，Pictures of a Leptin+/+（left）and a Leptin-/-（right）rat at 6 months of age.B，The protein expression levels in liver tissues were determined by western blot.C，Body weightwasmeasured over 8 months for Leptin+/+（n=5）and Leptin-/-（n=5）females.D，Body weightwasmeasured over 8 months for Leptin+/+（n=4），Leptin-/-（n=2）males.*，P＜0.05 vs.controls.Fig.1 Leptin-/-rats are obese

取材4、8月齡雌性Leptin-/-大鼠及Leptin +/+大鼠的胰腺組織固定，石蠟包埋及切片，HE染色觀察基因敲除大鼠胰腺病理學(xué)變化（彩插7圖4）。結(jié)果顯示，6月齡Leptin-/-大鼠與Leptin+/+大鼠相比，胰島體積增大，但是數(shù)量增多不明顯，且胰腺也沒有脂肪細(xì)胞浸潤，而8月齡Leptin-/-大鼠胰島數(shù)量明顯增多，體積增大更顯著，胰腺內(nèi)較多脂肪細(xì)胞浸潤，胰島形態(tài)由于快速擴(kuò)張而極不規(guī)則。胰島素抗體免疫組化顯示，4、8月齡Leptin -/-大鼠β細(xì)胞增多，胰島素分泌大大增加（彩插7圖4）。

圖2 Leptin-/-基因敲除大鼠空腹血糖受損Note：Fasting blood glucose of female Leptin+/+（n=5）and Leptin-/-rats（n=5）at1，3，6，8 months of age.*，P ＜0.05 vs.controls.Fig.2 Leptin deficiency-induced impaired fasting blood glucose

3 討論

相對小鼠而言，大鼠在營養(yǎng)和代謝等方面更接近人類，而且積累的生理學(xué)數(shù)據(jù)更多［12］。大鼠的內(nèi)分泌腺容易手術(shù)摘除，常用于研究各種腺體對全身生理生化功能的調(diào)節(jié)；激素腺體和靶器官的相互作用；激素對生殖生理功能的影響，如發(fā)情、排卵、胚胎著床等的調(diào)控作用。還有自發(fā)或誘發(fā)性內(nèi)分泌功能失調(diào)造成的疾病模型，如：糖尿病、甲狀腺功能低下、甲狀旁腺功能低下、尿崩癥等的大鼠模型。大鼠還是營養(yǎng)學(xué)研究的重要動物，大量維生素A、B、C和蛋白質(zhì)缺乏等營養(yǎng)代謝研究，還常作氨基酸和鈣、磷代謝研究。基于大鼠在內(nèi)分泌、代謝等疾病模型方面的研究優(yōu)勢，建立Leptin基因敲除大鼠模型，可以為營養(yǎng)、代謝類疾病研究提供更優(yōu)良的動物模型。

糖尿病前期是介于糖尿病和正常血糖之間的一種狀態(tài)，被認(rèn)為是糖尿病的必經(jīng)階段，是糖尿病的預(yù)警信號［13-16］。糖尿病前期時，糖調(diào)節(jié)已受損，包括空腹血糖受損（IFG）和葡萄糖耐量減退（IGT）。對人類而言，其中空腹血糖受損是指空腹血糖高于正常且又低于糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)（在6.1～7.0 mmol/L之間）［17］。Sighild Westman［18-20］報道ob/ob小鼠自1月齡血糖高于野生瘦小鼠，2～3月齡期間持續(xù)升高，4～7月齡之間血糖下降，7月齡時和野生組沒有差異。因此，ob/ob小鼠可以作為一種糖尿病前期模型［4，18］。本研究中Leptin-/-大鼠空腹血糖值從1月齡起就高于野生大鼠，2～3月齡期間血糖持續(xù)升高，4～8月齡時血糖下降，8月齡時仍然比野生大鼠高出11％，因此Leptin-/-大鼠也可以作為一種前期糖尿病模型，而且由于大鼠Leptin-/-的高血糖維持時間要比ob/ob小鼠更長，在作為糖尿病模型方面將更具優(yōu)勢。

Westman［21］發(fā)現(xiàn)ob/ob小鼠存活期間，胰島β細(xì)胞不斷增殖，胰島素釋放能力居高不下，并不發(fā)展成不可代償?shù)摩录?xì)胞損傷。但也跟遺傳背景相關(guān)，如KsJob小鼠有胰島功能損傷和脂毒性胰島損傷［22］，而在6J背景下卻沒有［23］。本研究中Leptin -/-大鼠超背景為SD，胰島病理觀察發(fā)現(xiàn)，4月齡Leptin-/-大鼠胰島體積增大，數(shù)量增多不明顯，而8月齡 Leptin-/-大鼠胰腺內(nèi)胰島數(shù)量明顯增多，體積增大，胰島素陽性β細(xì)胞增多。結(jié)果提示，Leptin-/-大鼠胰島增生，胰島素分泌不斷增加以應(yīng)答血糖升高。因此，Leptin-/-大鼠可以作為一種胰島β細(xì)胞增殖與功能研究模型。

Mathur等［24］發(fā)現(xiàn)瘦素抵抗的肥胖小鼠的胰腺脂肪浸潤程度高于對照組，說明肥胖與胰腺脂肪浸潤存在相關(guān)性。另一方面，脂肪胰還與代謝綜合征相關(guān)，Tushuizen等［25］測量了脂肪胰患者空腹和餐后的血糖及血清胰島素水平，發(fā)現(xiàn)脂肪胰患者的胰島β細(xì)胞功能較健康對照者顯著下降。推測胰島周圍的脂肪細(xì)胞可能會影響胰腺內(nèi)胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，隨后誘發(fā)胰島細(xì)胞的壞死和脂肪組織替代。Leptin-/-大鼠具有脂肪肝和脂肪胰表型，可以作為一個模型系統(tǒng)用于脂肪肝和脂肪胰疾病研究。

綜上所述，本研究中Leptin-/-大鼠1月齡起表現(xiàn)肥胖，8月齡時體重可以達(dá)到野生鼠的2倍左右，8月齡時肝臟可發(fā)展為脂肪肝，胰腺內(nèi)胰島增生、β細(xì)胞增多，胰島素分泌增加。大鼠壽命比小鼠長，且發(fā)病慢，持續(xù)時間長，因此該基因敲除大鼠可以成為肝臟脂肪毒性、胰島β細(xì)胞功能、早期糖尿病和肥胖等研究的更好的工具動物模型。

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Long-time observation of blood glucose and pathological phenotype of leptin knockout obese rats

ZHANG Li，GUAN Fei-fei，ZHANG Xu，CHENWei，SUN Cai-xian，ZHANG Lian-feng
（Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health；Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences（CAMS）＆Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical College（PUMC），Beijing 100021，China）

Objective To obtain more physiological data of Leptin knockout SD rats available for the user，the long-term observation of fasting blood glucose and pathological phenotypes were performed.M ethods The protein expression levels in liver tissueswere determined by western blot.Body weight of Leptin knockout rats（Leptin-/-）and littermate lean rats（Leptin+/+）were weighed up at1，3，6，8 months of age.Fasting blood glucose of Leptin+/+rats and Leptin-/-rats at 1，3，6，8 months of age were measured using One Touch? brand blood glucose monitoring systems.Pathological changes of pancreas and livers of Leptin-/-ratswere observed by themethod of HE staining and Immunohistochemistry（IHC）.Results Short null Lepin proteins were expressed in liver tissues from Leptin-/-rats.Leptin-/-rats become heavier than Leptin+/+rats since they were one month old.The body weight of Leptin-/-rats at8 months of age was twice as heavy as Leptin+/+rats，female Leptin-/-ratsweighing 884g，and male Leptin -/-ratsweighing 1200g.Overthyperglycemiawas observed during the firstmonth after birth.Compared with Leptin+/+female rats，the fasting blood glucose of Leptin-/-female ratswas increased by 40％-26％from 1 to 6 months old.After that，blood glucose values decreased and eventually become nearly normal at 8 months of age.Pathological examination indicated that Leptin-/-rats at8months of age had a fatty liver，more pancreas isletswith lager volume and more beta cells with increased insulin secretion.Conclusion Leptin-/-ratwere characterized by obesity，fatty liver，islet cell hyperplasia and early hyperglycemia.

Leptin；Knock out；Fasting blood glucose；Obesity；Rat

R332

A

1671-7856（2014）03-0045-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.010

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項課題“嚙齒類研發(fā)平臺創(chuàng)新藥物研究開發(fā)技術(shù)平臺建設(shè)”（2011ZX09307-302）；國家科技支撐計劃課題“神經(jīng)和代謝疾病基因工程模型的建立”（2012BAI39B02）.

張麗，女，博士，E-mail：zhangliqq2004@126.com。

張連峰，E-mail：Zhanglf@cnilas.org。

2014-02-14

研究報告