IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓造血干/祖細(xì)胞向髓系細(xì)胞分化的能力增強(qiáng)

白 琳，石桂英，高 珊，楊亞軍，高 昆，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓造血干/祖細(xì)胞向髓系細(xì)胞分化的能力增強(qiáng)

白 琳，石桂英，高 珊，楊亞軍，高 昆，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

目的 利用IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠研究IL-33對造血干/祖細(xì)胞的增殖和分化影響。方法 利用流式細(xì)胞儀分析IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠及同窩野生對照小鼠的外周血、脾臟、骨髓細(xì)胞的免疫表型及造血干細(xì)胞分化不同階段細(xì)胞的數(shù)量變化；利用體外成克隆實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期分析研究IL-33對于造血干細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果與野生型小鼠相比，IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠B細(xì)胞和T細(xì)胞在外周血中都明顯降低，粒細(xì)胞在外周血和骨髓中都有明顯增加；IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓造血干細(xì)胞和多能祖細(xì)胞數(shù)量減少，共同淋系祖細(xì)胞數(shù)量減少，共同髓系祖細(xì)胞和粒單系祖細(xì)胞數(shù)量增加；IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠的造血干細(xì)胞處于S-G2-M的細(xì)胞增多；體外單克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠造血干細(xì)胞形成的集落數(shù)增加。結(jié)論 IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠造血干細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，更易向髓系細(xì)胞分化。

IL-33；流式細(xì)胞術(shù)；骨髓造血干細(xì)胞；髓系細(xì)胞

白細(xì)胞介素33（Interleukin 33，IL-33）是IL-1類細(xì)胞因子家族的成員，通過與其受體ST2結(jié)合誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生。IL-33主要表達(dá)于Th2輔助性淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等細(xì)胞表面。IL-33既可以作為可溶性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞免疫刺激肥大細(xì)胞產(chǎn)生前炎性因子，又可以作為核基因調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄［1］。在臨床上IL-33和ST2與自身免疫病、變態(tài)反應(yīng)性疾病、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

IL-33的受體ST2在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞不同的亞群中表達(dá)，包括了造血干細(xì)胞、共同髓系祖細(xì)胞、共同淋系祖細(xì)胞、粒單系祖細(xì)胞和巨核單系祖細(xì)胞。在腸中CD34+Scal-1+細(xì)胞可以由IL-2和IL-33刺激產(chǎn)生的IL-5和IL-9誘導(dǎo)細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞［2］。IL-33與其他炎癥一樣可以誘導(dǎo)髓系細(xì)胞在外周血中過度堆積［3］。但是IL-33是否直接調(diào)節(jié)造血干/祖細(xì)胞還沒有明確的研究。本研究利用IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠研究其對造血干細(xì)胞增殖和分化的作用。

1 材料和方法

1.1 動物與設(shè)備

IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠由本所構(gòu)建［4-5］并繁育，遺傳背景為C57BL/6J小鼠【SCXK（京）2009-007】。實(shí)驗(yàn)中涉及動物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)（GC-08-2018）。

主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備為美國 BD公司 Aria流式細(xì)胞儀。

1.2 流式分析

外周血細(xì)胞取自小鼠眼眶，裂解紅細(xì)胞后，獲得外周血細(xì)胞懸液。小鼠脫頸椎處死后，取脾臟、胸腺、后肢骨，置于冰上預(yù)冷的PBS中。脾臟和胸腺用磨砂玻片研磨成細(xì)胞懸液；后肢骨用5mL注射器將骨髓細(xì)胞沖出，并吹打成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，取106細(xì)胞標(biāo)記熒光抗體。

骨髓造血干細(xì)胞的分析中用如下抗體進(jìn)行標(biāo)記：CD34-FITC、Flt3-PE、CD16/32-Pcrcp-cy5.5、Sca1-PE-Cy7、cKit-APC、Ter-119-Biotin、Gr-1-Biotin、Mac-1-Biotin、B220-Biotin、IL-7R-Biotin、CD4-Biotin、CD8-Biotin、Biotin-APC-Cy7。脾臟、胸腺及外周血細(xì)胞標(biāo)記抗體：CD4-FITC、CD8-Pcrcpcy5.5、B220-PE-Cy7、CD11B-APC-Cy7。上述抗體加入細(xì)胞懸液，冰上避光，30 min；加1 mL染色緩沖液，離心，2600 r/min，5 min，棄上清，加200μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，用50μm尼龍濾膜過濾，冰上避光。使用美國BD公司Aria流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 體外克隆形成實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞染色后，流式細(xì)胞儀分選長期造血干細(xì)胞（Lin-c-Kit+Sca1+CD34-Flt3-）到U型底96孔板中進(jìn)行單個干細(xì)胞的培養(yǎng)，14 d后記錄克隆的數(shù)目和大小，判斷長期造血干細(xì)胞增殖能力。

1.4 細(xì)胞周期分析

分離小鼠骨髓細(xì)胞，進(jìn)行造血干細(xì)胞染色Sca1-PE-Cy7、cKit-APC、Biotin-APC-Cy7。利用BD固定破膜液處理細(xì)胞后，加入Ki67-FITC和7-AAD進(jìn)行染色，使用美國BD公司Aria流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)均采用x±s表示。組間資料分析采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-33對免疫細(xì)胞的影響

為了了解IL-33對于免疫細(xì)胞的影響，我們選取了2月齡的IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩野生型對照小鼠各5只，進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)。分別取小鼠的外周血、骨髓、脾臟和胸腺組織的細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測其免疫細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示與對照相比，在外周血中IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠的B細(xì)胞（B220+）（圖1A）和T細(xì)胞（CD3+）（圖1B）比例明顯降低，粒細(xì)胞（CD11b+）比例增加（圖1C）；骨髓中粒細(xì)胞比例明顯增加（圖1C）。骨髓、脾臟和胸腺中的B細(xì)胞和T細(xì)胞沒有明顯變化（圖1A和B）。結(jié)果表明，IL-33過表達(dá)對于小鼠免疫系統(tǒng)有著重要影響，特別是髓系細(xì)胞變化明顯。

2.2 IL-33對造血干細(xì)胞的影響

IL-33的靶細(xì)胞包括了造血干細(xì)胞在內(nèi)的大多數(shù)的免疫細(xì)胞［6］，為了研究IL-33過表達(dá)對于造血干細(xì)胞的影響，我們分析了造血干細(xì)胞的數(shù)量。骨髓造血干細(xì)胞表面標(biāo)記為：LSK（Lin-c-Kit+Sca-1+），長期造血干細(xì)胞表面標(biāo)記為：LT-HSC（Lin-c-Kit+Sca-1+CD34-Flt3-），短期造血干細(xì)胞表面標(biāo)記為：ST-HSC（Lin-c-Kit+Sca-1+CD34+Flt3-），多能干細(xì)胞表面標(biāo)記為：MPP（Lin-c-Kit+Sca-1+CD34+Flt3+）［7］。與野生型小鼠相比，IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠的造血干細(xì)胞數(shù)量明顯降低，其中多能干細(xì)胞的數(shù)量降低的最為明顯，長期造血干細(xì)胞和短期造血干細(xì)胞的數(shù)量沒有明顯變化。因此，IL-33過表達(dá)降低了多能干細(xì)胞的數(shù)量。

圖1 IL-33過表達(dá)對免疫細(xì)胞的影響Note：A：percent of B cell in peripheral blood（PB），bone marrow（BM）and spleen；B：percent of T cell in the PB，spleen and thymus；C：percent of M cell in the PB and BM.Fig.1 IL-33 over-expression influence the cells of peripheral blood，bonemarrow，spleen and thymus

2.3 IL-33對造血祖細(xì)胞的影響

造血干細(xì)胞有不同層級的分化，多能祖細(xì)胞可以繼續(xù)分化為共同淋系祖細(xì)胞（common lymphoid progenitor，CLP，Lin-c-kitlowSca-1lowCD127+）［8］（圖 3A）和共同髓系祖細(xì)胞（common myeloid progenitor，CMP，Lin-c-Kit+Sca-1-CD34+CD16/CD32-）。共同淋系祖細(xì)胞進(jìn)而分化為B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞。共同髓系祖細(xì)胞進(jìn)而分化為粒單系祖細(xì)胞（granulocyte-macrophage progenitor，GMP，Lin-c-Kit+Sca-1-CD34+CD16/CD32+）和巨核單系祖細(xì)胞（megakaryocyte-erythroid progenitor，MEP，Lin-c-Kit+Sca-1-CD34-CD16/CD32-）［9］（圖3B）。GMP最終分化為粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，MEP最終分化為血小板和紅細(xì)胞。我們依據(jù)不同的標(biāo)記物檢測了IL-33對于造血祖細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠的共同淋系祖細(xì)胞數(shù)量降低，與外周血中B細(xì)胞和T細(xì)胞比例降低一致。而共同髓系祖細(xì)胞和粒單系祖細(xì)胞數(shù)量增加，與粒細(xì)胞比例增加一致。因此，IL-33過表達(dá)可能促進(jìn)了髓系細(xì)胞的分化。

2.4 IL-33對造血干細(xì)胞成克隆能力的影響

為了了解IL-33對造血干細(xì)胞增殖能力的作用，我們分選了長期造血干細(xì)胞，接種于96孔板中的甲基纖維素培養(yǎng)基中，14 d后顯微鏡下觀察計(jì)算克隆數(shù)量和大小。結(jié)果顯示，IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠來源的造血干細(xì)胞產(chǎn)生更多的中克隆和小克?。▓D4），說明IL-33部分程度上促進(jìn)了造血干細(xì)胞的增殖能力。

2.5 IL-33促進(jìn)造血干細(xì)胞的細(xì)胞周期

我們利用細(xì)胞增殖的標(biāo)記物Ki-67和DNA染料7-AAD來鑒定造血干細(xì)胞的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠的造血干細(xì)胞處于G0期（Ki-67-7-AAD-）細(xì)胞減少，處于細(xì)胞周期G1和S-G2-M的細(xì)胞增多（圖5）。結(jié)果說明，IL-33使得造血干細(xì)胞進(jìn)入了細(xì)胞周期。

3 討論

IL-33屬于IL-1家族成員，在多種免疫過程中發(fā)揮重要作用。近來很多實(shí)驗(yàn)表明造血干細(xì)胞可以參與免疫調(diào)節(jié)，因此IL-33在調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞中可能發(fā)揮著重要作用。本研究利用IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)，IL-33誘導(dǎo)造血干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖，并且更多造血干細(xì)胞分化為髓系細(xì)胞。IL-33對造血祖細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用更加明顯。

IL-33與其他免疫因子相似，會通過促進(jìn)造血生長因子的產(chǎn)生誘導(dǎo)髓系細(xì)胞在外周血中聚集和激活［10-11］。我們的研究也發(fā)現(xiàn)在外周血和骨髓中，IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠的粒細(xì)胞都是明顯增加的。而其共同髓系祖細(xì)胞和粒單系祖細(xì)胞也是明顯增加的。同時我們通過單克隆實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，IL-33轉(zhuǎn)基因來源的造血干細(xì)胞形成了更多的粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的克隆。因此，IL-33的增加可能直接或間接地促進(jìn)了造血祖細(xì)胞向髓系細(xì)胞的分化。

IL-33通過其受體ST-2激活相關(guān)的信號傳導(dǎo)蛋白，將活化的信號傳遞到胞內(nèi)，激活 NF-ΚB和MAPK等信號途徑，在細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)以及多種人類疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用［12］。因此，IL-33調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的信號通路及關(guān)鍵的分子仍然需要進(jìn)一步的研究。

圖2 IL-33過表達(dá)對造血干細(xì)胞的影響Note：A：Representative staining profiles for the HSCs and progenitor populations in BM.B and C：cell number of LSK and LT-HSC，ST-HSC，MPP.Fig.2 IL-33 over-expression influence the number of HSCs

圖3 IL-33過表達(dá)對造血祖細(xì)胞的影響Note：A：Representative staining profiles for the CLP in BM.B：Representative staining profiles for the CMP in BM.C：cell number of CLP.D：cell number of CMP.Fig.3 IL-33 over-expression influence the number of HPCs

圖4 IL-33促進(jìn)了造血干細(xì)胞成克隆能力

圖5 IL-33影響骨髓造血干細(xì)胞的細(xì)胞周期

［1］Ali S，Mohs A，Thomas M，etal.The dual function cytokine IL-33 interacts with the transcription factor NF-kappaB to dampen NF-kappaB-stimulated gene transcription［J］.Immunol，2011，187（4）：1609-1616.

［2］Hepworth MR，Danilowicz-Luebert E，Rausch S，et al.Mast cells orchestrate type 2 immunity to helminths through regulation of tissue-derived cytokines［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（17）：6644-6649.

［3］Takizawa H，Boettcher S，Manz MG..Demand-adapted regulation of early hematopoiesis in infection and inflammation［J］.Blood，2012，119（13）：2991-3002.

［4］Zhiguang X，Wei C，Steven R，et al.Over-expression of IL-33 leads to spontaneous pulmonary inflammation in m IL-33 transgenic mice［J］.Immunol Lett，2010，131（2）：159-165.

［5］Gao K，Li X，Zhang L，et al.Transgenic expression of IL-33 activates CD8（+）T cells and NK cells and inhibits tumor growth and metastasis in mice［J］.Cancer Lett，2013，335 （2）：463-471.

［6］Le H，Kim W，Kim J，et al.Interleukin-33：a mediator of inflammation targeting hematopoietic stem and progenitor cells and their progenies［J］.Front Immunol，2013，4：104.

［7］Bai L，Shi G，Zhang X，et al.Transgenic expression of BRCA1 disturbs hematopoietic stem and progenitor cells quiescence and function［J］.Exp Cell Res，2013，319（17）：2739-2746.

［8］Kondo M，Weissman IL，Akashi K.Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bonemarrow［J］.Cell，1997，91（5）：661-672.

［9］Akashi K，Traver D，Miyamoto T，et al.A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages［J］.Nature，2000，404（6774）：193-197.

［10］Schneider E，Petit-Bertron AF，Bricard R，etal.IL-33 activates unprimed murine basophils directly in vitro and induces their in vivo expansion indirectly by promoting hematopoietic growth factor production［J］.J Immunol，2009，183（6）：3591-3597.

［11］Schmitz J，Owyang A，Oldham E，et al.IL-33，an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines［J］.Immunity，2005，23（5）：479-490.

［12］Chackerian AA，Oldham ER，Murphy EE，et al.IL-1 receptor accessory protein and ST2 comprise the IL-33 receptor complex［J］.J Immunol，2007，179（4）：2551-2555.

IL-33 transgenic m ice increase them yeloid differentiation in hematopoietic stem cells

BAILin，SHIGui-ying，GAO Shan，YANG Ya-jun，GAO Kun，ZHANG Lian-feng
（Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health；Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences（CAMS）＆Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical College（PUMC），Beijing 100021，China）

Objective To study the influence of IL-33 on the Hematopoietic stem cells and progenitor cells.M ethods Cells from the peripheral blood，spleen，thymus and bonemarrow were stained with indicated antibodies and analyzed by flow cytometry.The LT-HSCs were sorted and culture using in vitro clonogenic assay.Results The percentage of B cells and T cellswas decreased and the percentage ofM cellswas increased in the peripheral blood from IL-33 transgenicmice.Compared with thewildtypemice，the number of HSCs，MPPs and CLPwas decreased；meanwhile the number of CMP and GMP was increased in the bone marrow from IL-33 transgenic mice.An in vitro clonogenic assay showed that LT-HSCs increased the ability to self-renew from IL-33 transgenic mice.And the percentage of S-G2-M stage hematopoietic stem cellwas increased from IL-33 transgenicmice.Conclusion IL-33 increase themyeloid differentiationin hematopoietic stem cells.

IL-33；Flow cytometry；Hematopoietic stem cell；Myeloid

R-332

A

1671-7856（2014）03-0039-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.009

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81200256）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金新教師類資助課題（20121106120034）。

白琳（1984-），女，助理研究員，博士。研究方向：干細(xì)胞與衰老。E-mail：bailin49@163.com。

張連峰，E-mail：Zhanglf@cnilas.org。

2014-01-07

研究報告