超快速液相色譜－四極桿／線性離子阱質譜同時檢測豬組織中9種β－受體阻斷劑殘留

張鴻偉， 許 輝， 高建國， 梁成珠， 徐 彪，耿 娟， 王鳳美， 張曉梅， 程 剛

（1.山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，山東 青島266002；2.青島出入境檢驗檢疫局，山東 青島266001）

β－受體阻斷劑（β－blockers，BBs）是一類能選擇性地與β－腎上腺素受體結合，從而拮抗神經遞質和兒茶酚胺對β－受體激動作用的藥物，是臨床上防治心律失常、心絞痛、高血壓、心動過速、甲狀腺毒癥、肥厚性主動脈狹窄以及心臟梗死的首選治療劑［1，2］。由于該類藥物具有一定的鎮(zhèn)靜作用，能提高某些運動項目的成績，常被非法使用于體育賽事而被世界反興奮劑組織（WADA）所禁用［3］。BBs在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中也常被非法用作鎮(zhèn)靜劑，一方面通過降低動物的運動量來促進飼料轉化率；另一方面還可緩解應激反應以降低動物在運輸、交配、分娩等壓力下的發(fā)病率和死亡率以及避免對肉質的不良影響［4，5］。BBs常通過肌肉注射和靜脈注射方式給藥，且往往在動物屠宰或運輸前數小時使用，導致其在可食動物組織中殘留風險較高，對人體造成的健康風險更大。目前，國際上一些地區(qū)和組織已對BBs類藥物卡拉洛爾（carazolol）在動物組織中的殘留限量做出了明確要求［6，7］（歐盟和國際食品法典委員會規(guī)定豬肌肉中殘留限量為5μg／kg，豬肝、腎為25 μg／kg）。我國當前既未批準BBs可作為獸藥使用，也未明確相關限量要求。經濟利益的驅動使得BBs在畜牧養(yǎng)殖加工業(yè)中存在違法使用的風險，因此建立快速、準確、靈敏的檢測方法尤為必要。

關于食源性動物組織中BBs殘留分析的報道相對較少，現(xiàn)有文獻多采用液相色譜－串聯(lián)質譜（LCMS／MS）進行檢測。由于動物源基質的復雜性，BBs殘留分析前處理過程多涉及液－液萃取（LLE）、固相萃?。⊿PE）凈化等過程，處理通量較低［8，9］。而快速分析［10］則因通量因素導致凈化程度不夠，方法定量限水平較高（～20μg／kg）。隨著Anastassiades等［11］基于QuEChERS方法使用N－丙基乙二胺（PSA）進行分散固相萃?。╠ispersive solid－phase extraction，d－SPE）凈化，d－SPE技術以其簡單快速、效果明顯的特點在生物樣品藥物殘留分析中應用逐漸廣泛［12－14］。近年來超高效／快速液相色譜（UPLC／UFLC）和亞2μm色譜柱技術的發(fā)展成熟給分析領域帶來了新的變化，高通量超快速分析已成為殘留分析的發(fā)展趨勢［15］；另外，雜交型串聯(lián)質譜儀，如四極桿／線性離子阱串聯(lián)質譜儀（Q／Trap MS）因兼具四極桿與離子阱雙重功能，可快速完成檢測和確證的相關報道也逐年增多［16－18］。本文綜合應用d－SPE凈化、超快速色譜分離、雜交質譜儀高級質譜采集模式等手段建立了豬組織中9種BBs（阿替洛爾、吲哚洛爾、醋丁洛爾、美托洛爾、卡拉洛爾、拉貝洛爾、比索洛爾、普萘洛爾和噴布洛爾）殘留的快速檢測技術。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1290 Infinity超快速液相色譜儀（美國Agilent公司）；5500 Q／Trap四極桿／線性離子阱質譜儀（美國AB Sciex公司），配有電噴霧離子源（ESI），應用軟件為Analyst（1.5.2版本）；CR22GⅡ高速冷凍離心機（日本 Hitachi公司）；Caliper TurboVap?LV高通量水浴氮吹濃縮儀（美國Caliper公司）；SHAB水浴恒溫振蕩器（中國國華公司）。

甲醇、乙腈（LC－MS級，美國 Merck公司），β－葡糖苷酸／硫酸酯酶、乙酸、甲酸及甲酸銨（分析純，美國Sigma－Aldrich公司）；乙酸銨、氯化鈉、Na2EDTA、氫氧化鈉均為國產分析純試劑；水為Milli－Q Advantage A10系統(tǒng)制備的超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

乙酸銨緩沖液：15.4 g乙酸銨用水溶解并定容至1 L，用乙酸調pH值為5.2。提取溶液：將37.5 g Na2EDTA溶于乙酸銨緩沖液中并定容至1 L。

BBs標準品：阿替洛爾（atenolol，純度99.0%）、美托洛爾（metoprolol tartrate，純度99.5%）、卡拉洛爾（carazolol，純度99.0%）和比索洛爾（bisoprolol fumarate，純度99.0%）（德國 Dr.Ehrenstorfer公司）；吲哚洛爾（pindolol，純度98.0%）和拉貝洛爾（labetalol hydrochloride，純度98.0%）（加拿大 Toronto Research Chemicals公司）；醋丁洛爾（acebutolol hydrochloride，純度100%）和普萘洛爾（propranolol hydrochloride，純 度 100%）（美 國 Sigma－Aldrich公司）；噴布洛爾（penbutolol sulfate，純度99.0%）（歐洲藥品質量和衛(wèi)生保健理事會（EDQM））；BBs氘代同位素內標：atenolol－d7（純度98.0%）、pindolol－d7（純 度 97.0%）、acebutolol－d5（純度98.0%）、metoprolol－d7（純度98.0%）、bisoprolol－d5（純 度 98.0%）和 penbutolol－d9 hydrochloride（純 度99.6%）（加拿大 Toronto Research Chemicals公司）；carazolol－d7（純度99.5%）（德國 Dr.Ehrenstorfer公司）；propranolol－d7（純 度 99.0%）（加 拿 大 C／D／N Isotopes公司）。

BBs標準溶液：除比索洛爾外，分別取其他BBs標準品10.0 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容配制成1.0 g／L的標準儲備液，于－20℃保存；比索洛爾標準品為0.01 g／L 的乙腈＋0.5%H3PO4水溶液（1∶1，v／v），可直接作為儲備液使用，于（20±4）℃保存。稱取各氘代內標5.0 mg于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容配制成0.1 g／L 的內標儲備液，于－20℃保存；實驗中用0.2%（v／v）甲酸水溶液稀釋上述標準儲備液，配制成不同濃度的混合標準工作液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

d－SPE凈化管（BondElut，15 mL，High Pigment）購自美國Agilent公司；硅藻土為國產分析純材料；實驗中所用豬肉、豬肝和豬腎樣品均為市售。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex?KinetexTMC18－XB（150 mm×2.1 mm，2.6μm）；柱溫：30 ℃；流速：0.25 mL／min；進樣量：3μL；流動相：A為甲醇，B為水（含0.1%（v／v）甲酸）；梯度洗脫程序：0～5 min，5%A～70%A；5～6 min，70%A～100%A；6～7 min，100%A；7～7.1 min，100%A～5%A；7.1～10 min，5%A。

1.2.2 質譜條件

離子化方式：ESI＋；采集模式：預設定多反應監(jiān)測－信息依賴性采集－增強子離子掃描（sMRM－IDAEPI）；sMRM參數：檢測窗口45 s，目標掃描時間1 s；IDA參數：采集閾值 3 000 cps（勾選動態(tài)背景扣除）；EPI參數：掃描速率 10 000 Da／s，掃描質量數范圍m／z 50～400，碰撞能量35 eV，擴展碰撞能量15 eV，離子阱時間選動態(tài)填充；離子源參數：離子源溫度500℃，霧化氣（氮氣）壓力0.276 MPa，氣簾氣（氮氣）壓力0.241 MPa，輔助氣（壓縮空氣）壓力0.344 MPa，電噴霧電壓5 500 V；化合物參數：BBs各化合物及其內標母離子、子離子的碰撞能量、多反應監(jiān)測離子對見表1。

表1 BBs類藥物及其內標sMRM模式下的質譜參數Table 1 MS parameters for BBs and their internal standards in sMRM mode

1.3 樣品前處理

稱取2.0 g均質后組織試樣，置于50 mL離心管中，加入混合內標溶液40μL（相當于試樣中含量2μg／kg），于暗處靜置15 min后加入β－葡糖苷酸／硫酸酯酶液40μL和提取溶液5 mL，渦旋1 min，50℃水浴中振蕩水解1 h，取出冷卻至室溫，用2 mol／L NaOH溶液調節(jié)其pH至10.0。

在提取液中加入25 mL乙腈、2 g硅藻土和2 g NaCl，渦旋后振蕩10 min，在0 ℃、10 000 r／min下離心10 min；取10 mL上清液加入d－SPE凈化管中，渦旋后振蕩5 min，在0℃、10 000 r／min 下離心5 min；取5 mL上清液于40℃下氮吹至近干，用0.5 mL甲醇超聲溶解后轉移至2 mL Eppendorf管中，在0℃、15 000 r／min下離心10 min，取上清液于40℃下氮氣吹干，準確加入1 mL甲醇－水（含0.2%（v／v）甲酸）（1∶9，v／v）復溶殘渣，過0.22μm濾膜后測定。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的選擇與優(yōu)化

BBs類藥物通常含有R－O－CH2－CH（OH）－CH2－NH－CH（CH3）2結構，在ESI＋條件下易形成質譜特征碎片離子 m／z 116［（N－異丙基－N－2－羥丙基胺）＋H］＋（見表1）；此外，常見的中性丟失有氨基、水、烯烴基等，碎片離子信息豐富［19］。在質譜方法建立時，盡可能采集更多的碎片離子用于方法的篩選，對于改善方法的性能指標如測定低限、準確度和精密度等有積極意義。以噴布洛爾為例，圖1顯示了其6個不同碎片離子組成的sMRM掃描標準溶液、腎臟基質空白和加標腎臟基質空白的質量色譜圖。由圖1可見，6個sMRM譜圖中m／z 292.2／74.0顯示出較強的基質干擾，導致選擇性差；m／z 292.2與113.1、168.1、56.0組成離子對的sMRM譜圖信噪比較差；故優(yōu)選出選擇性強、信噪比優(yōu)的 m／z 292.2／236.2與 m／z 292.2／201.2進行定量和定性。本文針對9種BBs及8種同位素內標共預選了91對sMRM離子進行篩選，優(yōu)選后的sMRM離子見表1。

歐盟2002／EC／657委員會決議［20］規(guī)定了質譜確證分析的相關要求，包括確證點的要求、離子比率和保留時間的容許范圍等。但在實際分析中，有時采用上述確證規(guī)則時會出現(xiàn)困擾。如Kaufmann等［21］發(fā)現(xiàn)對于單電荷離子存在多質子位點的化合物（如雙氟沙星等）采用歐盟確證規(guī)則會導致結果誤判。Dahane等［18］也認為在離子對響應差別較大（10倍以上）時采用歐盟規(guī)則進行低濃度水平確證分析存在困難。本文中噴布洛爾優(yōu)選的兩個離子對響應差別在6倍以上（見圖1），在低濃度水平時由于定性離子絕對響應較低，定量時容易導致離子比率接近容許限而出現(xiàn)結果判定困難。Q／Trap型質譜儀可在線實時獲取目標物的全掃描碎片圖譜，可作為確證分析的有效輔助判據［16－18］而改善判定困境。本文BBs在線質譜數據庫的構建采用sMRMIDA－EPI模式，質譜參數設定見1.2.2節(jié)，BBs混合標準溶液（2μg／L）在優(yōu)化的色譜條件（見1.2.1節(jié)）下分析，采集各目標物的EPI譜圖，同時采用空白組織（肝臟、腎臟和肌肉）基質制備BBs基質標準溶液（2μg／L），在相同條件下分析，采集相應的EPI譜圖，并與標準溶液采集的EPI譜圖進行在線比對。匹配分析使用 Analyst 1.5.2（AB SCIEX）軟件進行，結果顯示各目標物的EPI譜圖匹配純度（purity）值均大于95（完全匹配值為100），提示可使用標準溶液建立的EPI譜庫對測定樣品進行匹配分析。9種BBs混合標準溶液（2μg／L）按本文的色譜－質譜條件在線采集的EPI譜圖和選擇離子流圖見圖2。

2.2 色譜條件的選擇與優(yōu)化

9種BBs類藥物均為堿性化合物（p Ka≈9.5），其log P值范圍為0.34～4.02（使用歐洲生物信息研究所在線數據庫ACD軟件預測），顯示其極性范圍較寬。為了實現(xiàn)寬極性范圍堿性目標物的超快速色譜分析，除采用超快速色譜硬件系統(tǒng)外，色譜柱與流動相的選擇也是關鍵。

近年來，一些采用了新的填料類型或新型固定相結構的色譜柱在超快速分析中有更好的應用優(yōu)勢［22］，其中核－殼型色譜柱在堿性物質和寬極性范圍多殘留分析中有較好表現(xiàn)［16，23］。本文先后考察了5種不同類型、品牌和規(guī)格的C18色譜柱，分別為柱1（Shiseido Capcell MG III C18，150 mm×3.0 mm，5μm）、柱 2（Chromex Scientific Sunshell C18，150 mm×2.1 mm，2.6μm）、柱3（Merck Chromolith Performance C18e，100 mm ×2.1 mm）、柱4（Phenomenex Gemini－NX C18，150 mm×4.6 mm，3μm）和柱5（Phenomenex Kinetex C18－XB，150 mm×2.1 mm，2.6μm）。其中柱1適用于在酸性條件下分離堿性物質；柱2和柱5均為核－殼型色譜柱，傳質效率高，適合快速分析；柱3為整體柱，背壓極低，適合超高流速分析；柱4為B型硅膠固定相，可在高pH下進行堿性化合物分析。在流動相選擇上，堿性化合物分析通常多采用酸性流動相以減免硅醇殘基對離子化目標物的吸附作用而出現(xiàn)峰形不對稱、分辨率低或保留不重現(xiàn)等現(xiàn)象；或是采用堿性流動相選用耐堿色譜柱進行分析。因此，本文以水－甲醇／乙腈分別組合作為流動相，再選用氨水、甲酸、乙酸及其銨鹽為流動相修飾劑并調節(jié)洗脫梯度，選用適當的流動相體系，觀察不同條件下BBs混合標準溶液中目標物的分離度、色譜峰形、靈敏度及分析通量。結果顯示：這5種色譜柱均能在可接受的分離度下完成對9種BBs的超快速分析（單次分析循環(huán)不超過10 min），在4種適用酸性流動相體系的色譜柱中，柱5（Phenomenex Kinetex C18－XB）在靈敏度、色譜峰形和分離度上表現(xiàn)最優(yōu)，而柱1靈敏度較低，柱2和柱3靈敏度低且有峰拖尾現(xiàn)象；柱4使用堿性流動相體系（pH10.0）進行分析，在靈敏度、色譜峰形和分離度方面均與柱5相當，然而其優(yōu)化的流速為0.8 mL／min，而柱5的優(yōu)化流速為0.25 mL／min，在流動相和用氣量消耗方面柱5更為優(yōu)秀，故最終選擇核－殼型色譜柱（Phenomenex Kinetex C18－XB）為本文分析用柱。在流動相的選擇上，甲醇－水體系在10 min內可實現(xiàn)7種BBs的基線分離且在0.1%（v／v）甲酸的酸度下就能實現(xiàn)靈敏度和色譜峰形的優(yōu)化，而乙腈－水體系僅能實現(xiàn)6種BBs的基線分離且需在0.3%（v／v）甲酸下才能有較好的分離效果，故最終選擇流動相為甲醇與水（含0.1%（v／v）甲酸）并在1.2.1節(jié)的梯度條件下洗脫。9種BBs在優(yōu)化的色譜條件下的色譜圖見圖2中的XIC of sMRM圖。

圖1 （a）噴布洛爾標準溶液（2μg／L）、（b）腎臟空白基質和（c）添加噴布洛爾（2μg／L）的腎臟空白基質的sMRM 圖譜Fig.1 sMRM spectra of（a）standard solution of penbutolol（2μg／L），（b）blank kidney matrix and（c）the blank kidney matrix spiked with penbutolol at 2μg／L

圖2 9種BBs混合標準溶液（2μg／L）在線EPI譜圖及選擇離子流圖Fig.2 On－line EPI spectra and XIC chromatogram of the nine BBs acquired with composite standard solution（2μg／L）

2.3 前處理條件的優(yōu)化

BBs類部分藥物（通常為含有酚基結構的藥物如拉貝洛爾和卡拉洛爾）易在生物體內形成葡糖醛酸軛合物或硫酸軛合物［5，24］。本文選用快速酶解方法［25，26］保證了處理通量并解離了可能的結合態(tài)殘留藥物，接近中性（pH5.2）的酶解環(huán)境能顯著減少基質共萃取物［27］，緩沖液中加入EDTA可減免強極性目標物與金屬陽離子形成復合物而影響提取效率［2，28］。提取溶劑選擇乙腈是因其較甲醇有更好的蛋白沉淀作用、共萃取作用弱且可以鹽析分層，實驗顯示其提取液較為清澈，基質效應弱。BBs在水溶液中呈堿性，酶解完成后堿化水相和鹽析有利于目標物去電荷而向有機相分配，提升提取效率［2，29］。實驗分別調節(jié)pH值為9.5、10.0和11.0，結果顯示pH值為10.0時各目標物的提取效率最優(yōu)，這與文獻［30］的報道一致，故選擇調節(jié)pH為10.0。

基于QuEChERS方法的d－SPE技術可有效提高前處理通量。本文分別考察了硅藻土、C18填料以及QuEChERS方法組合凈化劑（MgSO4＋PSA＋C18）的d－SPE效果。結果顯示：在3種基質中，硅藻土和組合凈化劑的使用效果相當且均優(yōu)于C18填料，并以在肌肉基質中的使用效果最優(yōu)?；趯嶒灣杀究紤]，選用硅藻土為凈化吸附劑。然而對于肝、腎基質，僅采用一次d－SPE處理提取液，發(fā)現(xiàn)有明顯的色素存在，對低濃度水平（如0.5μg／kg）的分析有較強的影響。為了減弱基質干擾，本文采用BondElut組合凈化填料（150 mg PSA＋45 mg石墨化炭黑（GCB）＋855 mg MgSO4）進行二次d－SPE凈化（GCB和PSA均可吸附親脂性色素），并采用甲醇復溶進一步去除磷脂類干擾物以防止溶劑轉換導致的分析物損失［9，17］，再輔以高速冷凍離心，結果顯示：肝、腎基質的提取液明顯清澈，基質干擾現(xiàn)象減弱；肌肉基質經過二次凈化后，基質影響更為減弱。圖3顯示了3種豬組織空白基質與加標（0.5 μg／kg）空白基質的總離子流圖。

由圖3可見，在添加水平為0.5μg／kg時，3種豬組織中各目標物在保留時間窗口內無明顯干擾。另外，方法中各BBs的絕對回收率范圍為52.4%～76.2%，顯示本文離子對優(yōu)化選擇的有效性及前處理方法設計的合理性。此外，本文8種BBs同位素內標的sMRM離子（見表1）在其保留時間窗口內亦無明顯干擾（數據略）。同時，依據前處理絕對回收率計算結果，拉貝洛爾以吲哚洛爾氘代內標為內標（兩者絕對回收率最為接近）進行標準曲線制作及定量計算。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系和定量限

圖3 （a）加標（0.5μg／kg）豬空白組織和（b）豬空白組織的sMRM總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of（a）blank porcine tissues spiked with BBs at 0.5μg／kg and （b）blank porcine tissues

使用甲醇－水（含0.2%（v／v）甲酸）（1∶9，v／v）溶液配制質量濃度分別為0.10、0.20、0.50、1.0、5.0、10、20μg／L（同位素內標質量濃度均為 0.8 μg／L）的系列濃度標準溶液，在選定的色譜－質譜條件下測定，內標法定量，線性回歸采用1／x權重（校正低濃度端準確度），在滿足準確度在80%～120%的基礎上計算相關系數（r），9種BBs的線性關系見表2。由表2可見，BBs由于其質譜響應較高，其線性范圍有所收窄，換算成樣品中含量范圍為0.25～50μg／kg，表明方法在低濃度水平有更好的定量精度，有利于BBs濫用的控制。

本文以在空白組織基質中添加BBs，將定量離子對的信噪比≥10定義定量限，參照目前國際上對卡拉洛爾的限量要求及以提高風險監(jiān)測水平為目的，基質空白添加水平選取為0.5μg／kg，計算各目標物在此水平上的信噪比。結果顯示9種BBs在0.5μg／kg 添加水平時，3種豬組織基質中各目標物定量離子對的S／N≥15，說明采用本方法各目標物定量限均可達到0.5μg／kg。

表2 混合標準溶液中9種BBs的線性關系Table 2 Linear relationships of the nine BBs in a mixed standard solution

2.4.2 方法的回收率和精密度

本文分別選用空白豬肝、豬腎和豬肉基質，參照《進出口食品安全風險監(jiān)控實驗室質量控制指南［2011］398號》的規(guī)定，添加0.5、1.0和5.0μg／kg進行回收率測定，每個水平6個試樣，計算回收率與RSD，結果見表3。在3個添加水平下BBs的平均回收率為87.5%～111.8%，RSD≤12.5%，顯示本方法對豬組織BBs殘留測定有很好的適用性和可重復性。

2.4.3 方法的基質效應

為了控制基質效應，本文采取的措施有：①采用選擇性更好的sMRM。②采用了多重凈化措施。③采用同位素內標補償基質效應影響。選用了8種BBs同位素內標并優(yōu)化了監(jiān)測離子對（見表1），對沒有同位素內標的拉貝洛爾通過絕對回收率考察選擇了合適的替代內標，其定量結果顯示在3個添加水平上回收率為89.4%～106.1%，RSD≤12.5%，顯示了替代內標選擇的合理性。④稀釋提取液。通過縮減提取液體積降低引入基質組分的絕對量。⑤降低進樣量。將進樣量降低至3μL，減少基質負載。通過上述措施，本文建立的方法有效地控制了豬組織中BBs殘留分析的基質效應影響（見圖3），定量結果滿足殘留分析要求（見表3）。

表3 豬組織中9種BBs的加標回收率及精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations for the nine BBs spiked in blank porcine tissues（n＝6）

2.4.4 方法EPI譜圖譜庫比對純度閾值的確定

本文使用在線EPI譜圖譜庫比對進行BBs快速輔助確證。研究對定量限（0.5μg／kg）水平各組織基質中BBs的絕對響應進行評估，確定IDA掃描觸發(fā)閾值水平為3 000 cps，以標準溶液的EPI在線譜庫為參照庫（見圖2），參照文獻［16］的方法確定譜庫比對純度閾值為80。測試中樣品BBs的在線EPI譜圖匹配純度值超過80即可作為輔助確證分析的有效判據。

2.5 實際樣品檢測

使用本文建立的方法對從青島一農貿市場不同攤位采集的20份豬相關組織樣品進行BBs殘留測定分析，該批次測定樣品中未發(fā)現(xiàn)有相關BBs殘留。盡管此次采樣沒有監(jiān)測到相關物質殘留，但是對覆蓋不同地域不同來源的更廣泛的樣品進行BBs殘留監(jiān)測，對于食品安全風險監(jiān)控體系的完善有重要的實踐意義。

3 結論

本文使用超快速液相色譜－四極桿／離子阱質譜建立了豬組織中9種BBs殘留測定的分析方法。該研究進行了監(jiān)測離子對的篩選優(yōu)化，并采用雙重d－SPE等凈化手段有效控制了復雜動物源樣品的基質效應，降低了方法的定量限，質譜分析采用sMRM－IDA－EPI高級采集模式，在線EPI譜庫輔助確證分析，提高了檢測效能和確證可靠性。該方法快速簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好、適用性強，定量限滿足國內外相關法規(guī)要求，可有效用于BBs殘留監(jiān)控監(jiān)測和實驗室日常分析。

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