瀘州地區(qū)龍眼核中總黃酮提取工藝研究

王俊，王芳，傅秀娟，彭藝飛

（瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川瀘州646000）

龍眼為無患子科（Sapindaceae）龍眼屬（Dimocarpus Lour.）常綠果樹，喬木。龍眼營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，也是重要的藥材之一，龍眼殼、龍眼核、龍眼花和龍眼皮、根均可以作為配伍的中藥[1]。龍眼核性味澀、平，氣微，味淡而微苦，具有止血、定痛、理氣化濕等功效，用于治療創(chuàng)傷出血、疝氣、疥癬、濕瘡等，并有開胃健脾，補(bǔ)虛益智的功效。桂圓肉可以治療虛勞贏弱，失眠健忘，驚悸怔忡以及脾虛泄瀉，產(chǎn)后水腫等癥[2]。龍眼核的重量占龍眼果實(shí)鮮重的1/3，由于沒有很好地綜合利用，大多作為廢棄物丟棄，造成了浪費(fèi)和環(huán)境污染。在龍眼核中總黃酮的含量較高，研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物對(duì)心腦血管損傷、肝損傷、心律失常等具有調(diào)節(jié)作用，同時(shí)還具有抗自由基和抗腫瘤活性[2]。為探討超聲波乙醇浸提法和乙醇回流法提取龍眼核總黃酮的實(shí)驗(yàn)條件及效果，研究了各種因素對(duì)提取率的影響，同時(shí)通過正交法對(duì)龍眼核藥用成分的提取工藝進(jìn)行了較全面的探索，確定了龍眼核總黃酮量超聲提取的最佳工藝[3－4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥材

龍眼核：購(gòu)于瀘州市場(chǎng)。

1.1.2 主要儀器

UV1700PC紫外可見分光光度計(jì)：上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司；AS3120A超聲波清洗器、真空泵：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HH－W三用恒溫水箱：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；架盤藥物天平BP－Ⅱ型：上海醫(yī)用激光儀器廠。

1.1.3 主要試劑

95%乙醇AR；亞硝酸鈉AR；硝酸鋁AR；氫氧化鈉AR；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080－200306，中國(guó)藥品生物制品檢定所）。

1.2 方法

1.2.1 龍眼核中總黃酮的提取

1.2.1.1 超聲提取

精密稱取9份5.000 g研細(xì)的龍眼核粉末，置于250 mL磨口錐形瓶?jī)?nèi)，按料液比加入一定濃度的乙醇，分別按L9（34）正交設(shè)計(jì)方法進(jìn)行提取，抽濾，抽濾時(shí)用30%乙醇溶液少量頻繁的洗滌藥渣。將濾液用體積相近的容量瓶定容；并用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其總黃酮的含量。正交試驗(yàn)的因素和水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of orthoganal test

1.2.1.2 回流提取

精密稱取16份5.000 g研細(xì)的龍眼核粉末，置于250 mL圓底燒瓶。按料液比加入一定濃度乙醇溶液回流提取。將各組處理進(jìn)行抽濾，將濾液用適當(dāng)容量瓶分別定容；用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其總黃酮的含量。并且通過單因素試驗(yàn)考察不同因素對(duì)總黃酮含量的影響。

①不同回流時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響。固定料液比為 1∶11（W/V，下同），提取 3 次，選擇回流時(shí)間分別為 0.5、1、1.5、2、3 和 4 h 進(jìn)行試驗(yàn)，考察不同回流時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響。②不同料液比對(duì)總黃酮含量的影響。固定回流時(shí)間為3 h，回流提取3次，選擇料液比分別為 1∶7、1∶9、1∶11、1∶13 和 1∶15 進(jìn)行試驗(yàn)，考察不同料液比對(duì)總黃酮含量的影響。③不同回流次數(shù)對(duì)總黃酮含量的影響。固定料液比為1∶11，回流時(shí)間為3 h，選擇回流提取次數(shù)分別為1、2、3、4和5次進(jìn)行試驗(yàn)，考察不同回流次數(shù)對(duì)總黃酮含量的影響。

1.2.2 總黃酮的測(cè)定[5]

1.2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取10 mg烘干至恒重的蘆丁對(duì)照品，用30%乙醇溶液溶解并定容至100 mL，得0.10 mg/mL的蘆丁對(duì)照液。分別精密吸取0.10 mg/mL的蘆丁對(duì)照液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，分別加入10%亞硝酸鈉溶液0.50 mL，搖勻，靜置6 min；再加入10%硝酸鋁溶液0.50 mL，搖勻，靜置6 min；再加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，用30%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，靜置12min，以30%乙醇作為空白液，于510 nm處測(cè)吸光度。吸光度測(cè)量結(jié)果見表2。以濃度對(duì)吸光度回歸，得回歸方程 A=12.272C+0.016 3；r=0.996 9，結(jié)果表明，濃度在0.05 mg/mL～0.49 mg/mL范圍內(nèi)，濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

表2 紫外可見分光光度法測(cè)定蘆丁對(duì)照液的吸光度Table 2 Determining the absorbance by using UV spectrophotometric method

1.2.2.2 樣品中總黃酮的測(cè)定

精密吸取樣品液0.50 mL于10 mL容量瓶中，按照1.2.2.1方法測(cè)其吸光度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的含量。

1.2.3 超聲法和回流法最佳工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

分別選擇超聲法的最佳工藝即乙醇濃度60%，超聲3次，每次10 min，料液比1∶11；回流法的最佳工藝即回流3次，料液比 1∶11，回流3 h，平行3組進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，計(jì)算黃酮提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)及驗(yàn)證試驗(yàn)

2.1.1 正交試驗(yàn)

采用紫外分光光度法對(duì)9份樣品中總黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定，正交試驗(yàn)及方差分析見表3、表4。

表3直觀分析結(jié)果表明，各因素對(duì)提取黃酮的影響程度大小為：料液比＞乙醇濃度＞超聲次數(shù)＞超聲時(shí)間。由表4方差分析結(jié)果可知：料液比和乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響達(dá)到了顯著水平，是提取總黃酮的主要影響因素。正交試驗(yàn)中A2B3C2D1為最優(yōu)水平組合，因此確定乙醇濃度60%，超聲次數(shù)3次，料液比1∶11，每次10 min作為總黃酮提取的最佳工藝。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of the orthogonal experiment

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.1.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

精密稱取3份5.000 g研細(xì)的龍眼核粉末，置于250 mL磨口錐形瓶?jī)?nèi)，按照上述優(yōu)選提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果三批龍眼核總黃酮提取率穩(wěn)定，平均提取率為2.795%，結(jié)果見表5。

表5 總黃酮提取驗(yàn)證試驗(yàn)Table 5 Demonstration test of the extraction of total flavonoids

2.2 回流法單因素試驗(yàn)

2.2.1 回流時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

回流時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響見圖1。

由圖1可知，隨著提取時(shí)間的增加龍眼核中黃酮的提取率逐漸增加，提取時(shí)間超過3 h后，總黃酮的提取率隨回流時(shí)間的增加增幅變緩，考慮到生產(chǎn)周期和設(shè)備的利用率，確定回流時(shí)間以3 h為宜。

2.2.2 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

料液比對(duì)總黃酮提取率的影響見圖2。

圖1 回流時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 The effect of reflux time on the extraction rate of total flavonoids

圖2 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

由圖2可知，當(dāng)料液比為1：11時(shí)，龍眼核中總黃酮的提取率最高，因此確定料液比為1∶11。

2.2.3 回流次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

回流次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 回流次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 The effect of reflux times on the extraction rate of total flavonoids

由圖3可知，當(dāng)提取3次時(shí)，龍眼核中總黃酮的提取率最高，因此確定回流次數(shù)為3次。

2.3 超聲法和回流法最佳工藝的比較

超聲法和回流法的提取率見表6，由表6可知，采用超聲法提取龍眼核中總黃酮其平均提取率為2.795%，而采用回流提取法其平均提取率為2.394%，表明超聲提取更方便，有效，安全。故超聲法優(yōu)于回流提取法。

表6 不同提取方法結(jié)果Table 6 The test results by different extraction methods

3 結(jié)論與討論

文中對(duì)比了回流法和超聲法在龍眼核總黃酮提取工藝中的差異，目的在于確定一種較優(yōu)的提取工藝。

1）以蘆丁為對(duì)照品測(cè)定龍眼核中總黃酮的含量，加入鋁離子試劑，同時(shí)用氫氧化鈉溶液控制其pH，使黃酮化合物與鋁鹽形成絡(luò)合物，在510 nm處能獲得穩(wěn)定的特征吸收峰。

2）提取液應(yīng)趁熱抽濾，以防止乙醇揮發(fā)，在試驗(yàn)中應(yīng)用保鮮膜封住裝有乙醇的容器，所以操作應(yīng)當(dāng)仔細(xì)，減少誤差。

3）用回流法提取龍眼核中總黃酮，應(yīng)選擇的是索式提取器，方便提取操作的順利進(jìn)行。

4）通過兩種提取方法得到的結(jié)果來看，超聲法提取較回流法有更高的提取率。應(yīng)用該法工藝設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，提取時(shí)間短，是一條較為理想的方法，最佳工藝為以11倍量的60%乙醇超聲提取3次，每次10 min，最佳提取率為2.795%。

[1] 蔡長(zhǎng)河,唐小浪,張愛玉.龍眼果肉的食療價(jià)值及其開發(fā)應(yīng)用前景[J].食品科學(xué),2002(8):328-330

[2] 黃河勝,馬傳庚,陳志武.黃酮類化合物藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2000(10):589-592

[3] 賢景春,陳美贏.超聲提取龍眼核總黃酮量的工藝[J].食品研究與開發(fā),2010(4):5-7

[4] 陸海峰,趙進(jìn),李琳.超聲波提取龍眼葉總黃酮及其鑒別[J].微量元素與健康研究,2007(4):48-49

[5] 陳叢瑾,黃克瀛,李姣娟.植物中黃酮含量的光學(xué)測(cè)定方法研究進(jìn)展[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2007(4):524-530