絞股藍皂苷對嗅球損毀大鼠學習記憶能力減退的影響*

賀 婕 彭貴海 黃 琪 李德梅

（1.湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，湖北 十堰 442000；3.湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院，湖北十堰442000）

絞股藍皂苷對嗅球損毀大鼠學習記憶能力減退的影響*

賀 婕1彭貴海1黃 琪2李德梅3△

（1.湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，湖北 十堰 442000；3.湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院，湖北十堰442000）

目的觀察絞股藍皂苷對嗅球（OB）損毀AD模型大鼠學習記憶能力減退的影響。方法SD健康大鼠150只，隨機分為5組：OB損毀組，絞股藍皂苷高、中、低劑量干預組，正常對照組，每組30只。通過雙側OB損毀、復制AD大鼠模型。采用絞股藍皂苷連續(xù)灌胃，觀察各組大鼠行為學、海馬GAP-43蛋白和GAP-43 mRNA表達以及隔區(qū)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）免疫陽性神經(jīng)元數(shù)的變化。結果與OB損毀組比較，絞股藍皂苷中、高劑量組潛伏期明顯縮短、穿過平臺次數(shù)明顯增加（P＜0.05）；海馬GAP-43蛋白和GAP-43 mRNA表達明顯增多（P＜0.05）；內(nèi)側隔核和斜角帶垂直支中ChAT免疫陽性神經(jīng)元數(shù)也明顯增多（P＜0.05），且胞體變大、突起變長。絞股藍皂苷低劑量組與OB損毀組比較，上述各指標均無明顯差異（P＞0.05）。絞股藍皂苷中、高劑量組之間比較，上述各指標均有明顯差異（P＜0.05）。結論絞股藍皂苷可能通過提高海馬GAP-43蛋白和GAP-43 mRNA表達以及保護隔區(qū)膽堿能神經(jīng)元，改善OB損毀AD大鼠學習記憶功能。

阿爾茨海默病絞股藍皂苷學習記憶隔區(qū)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶膽堿能神經(jīng)元

阿爾茨海默病（AD）是一種以進行性認知功能障礙為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。近年來，越來越多的研究證據(jù)表明，嗅覺障礙與AD密切相關，而且可能是最早出現(xiàn)的癥狀之一［1-4］。本研究通過雙側嗅球（OB）損毀，建立AD大鼠模型，采用絞股藍皂苷連續(xù)灌胃作用于OB損毀大鼠，觀察各組大鼠行為學、海馬GAP-43蛋白和GAP-43mRNA表達以及隔區(qū)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）免疫陽性神經(jīng)元的變化；觀察絞股藍皂苷對OB損毀AD模型大鼠學習記憶能力減退的影響，為臨床有效防治AD提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組健康雄性SD大鼠150只，SPF級，12月齡，體質(zhì)量490～510g，均由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2005-0008。大鼠隨機分OB損毀AD模型組（簡稱OB損毀組）和絞股藍皂苷高、中、低劑量干預組，每組30只；另取SD健康大鼠30只確定為正常對照組。

1.2 試劑與藥品RT反應體系試劑及PCR反應體系試劑（Promega）；GAP-43引物、兔源GAP-43多克隆抗體（Chemicon），絞股藍皂苷（陜西浩洋生物，純度＞98％），大鼠ChAT單克隆抗體（Chemicom）。

1.3 OB損毀AD模型制備［5］術前用絞股藍皂苷給大鼠灌胃2周后，建立OB損毀AD動物模型。用35 g/L戊巴比妥鈉（35 g/kg）腹腔注射麻醉大鼠，切開皮膚、暴露顱骨，在前囟前7.5mm、正中線旁開2mm處，用牙鉆將顱骨鉆兩個直徑為2mm的小孔。用探針搗毀嗅球，吸出全部嗅球組織，填入明膠海綿止血。沖洗切口、縫合皮膚，肌注青霉素防術后感染。單籠飼養(yǎng)至大鼠完全清醒。

1.4 干預方法使用前，將絞股藍皂苷溶于生理鹽分別配制為12.5、25、37.5mg/mL的混懸液。絞股藍皂苷低、中、高劑量組分別給予絞股藍皂苷100、200、300mg/kg灌胃，術后連續(xù)4周；正常對照組與AD模型組則同時給予等量的生理鹽水灌胃。晝夜交替環(huán)境下飼養(yǎng)，自由取食及飲水。

1.5 Morris水迷宮行為學測試［6］（1）定位航行實驗：歷時5 d，從第1日起，每天分上、下午各訓練1次。訓練時隨機選擇一個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，讓大鼠尋找、游向并爬上平臺，記錄其潛伏期、運行時間；每次訓練時間為120 s。如果大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺，須將其引至平臺；這時潛伏期記為120 s，并記錄其錯誤次數(shù)1次；每次訓練后讓其在平臺上停留15 s。（2）空間搜索實驗：在第6日撤除水下平臺，隨機選取一入水點，在同一入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄其在120 s內(nèi)跨過原平臺相應位置的次數(shù)和第1次通過平臺的時間。

1.6 Western blotting檢測GAP-43蛋白［7］行為學測試后，5組各隨機抓取10只大鼠，取腦、迅速分離出海馬。海馬組織加裂解液勻漿后，離心取上清液，應用Bicinchoninic acid（BCA）法測定提取的蛋白濃度。配制12％分離膠進行蛋白SDS-PAGE變性電泳，電泳結束后，將蛋白電轉(zhuǎn)印至NC膜，結合兔源GAP-43多克隆抗體。內(nèi)參照為β-actin，實驗重復3次。計算各條帶的密度相對值。

1.7 RT-PCR技術檢測GAP-43 mRNA［7］行為學測試后，5組各隨機抓取10只大鼠，取腦、迅速分離出海馬。大鼠海馬組織勻漿后，加入Trizol提取總mRNA，并用試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將cDNA產(chǎn)物進行Real-time PCR循環(huán)。引物序列：GAP-43上游5′GGCTCTGCTACTACCGATCC3′，下游5′TTGGAGGAC GGCGAGTTA3′；β-actin上游5′TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3′，下游5′TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA3′。PCR反應參數(shù)：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸60 s，32個循環(huán)擴增。將GAP-43反應產(chǎn)物和β-actin的反應產(chǎn)物進行電泳。經(jīng)凝膠圖像分析系統(tǒng)，對RT-PCR產(chǎn)物的電泳條帶進行密度分析。

1.8 ChAT陽性細胞計數(shù)［8-9］將每組10只大鼠麻醉后打開胸腔，經(jīng)左心室、升主動脈快速灌注200mL生理鹽水（右心耳切開）洗凈血液，然后灌注0.1mol/LPB配制的10 g/L多聚甲醛，25 g/L戊二醛溶液400mL進行固定。1 h后取腦，在腦立體定位儀上取前囟前后4mm一段腦，后固定2 h，放入150、200、300 g/L蔗糖磷酸鹽緩沖液，梯度脫水，隔夜沉底。OCT包埋后入-80℃冷丙酮速凍，移至-28℃恒冷箱切片機平衡溫度后連續(xù)冠狀切片，片厚30μm。ChAT免疫組化染色按常規(guī)程序進行，特別注意大鼠ChAT單克隆抗體（1∶100）4℃孵育72 h，陰性對照結果為陰性。每只大鼠取5張切片，含隔區(qū)對應部位并在5組間保持斷面一致；光鏡下計算每張隨機10個視野內(nèi)側隔核和斜角帶垂直支中ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)、取其平均值作為計數(shù)結果，再取5張平均值為最后結果。

1.9 統(tǒng)計學處理應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學變化見表1。從表1可以看出，絞股藍皂苷干預前，與正常對照組比較，OB損毀組潛伏期明顯延長、穿過平臺次數(shù)明顯減少（P＜0.01），說明OB損毀AD模型制作成功。絞股藍皂苷干預結束后，與OB損毀組比較，絞股藍皂苷低劑量組潛伏期略有縮短、穿過平臺次數(shù)稍有增加（P＞0.05），而絞股藍皂苷中劑量組潛伏期明顯縮短、穿過平臺次數(shù)明顯增加（P＜0.05）；絞股藍皂苷高劑量組與絞股藍皂苷中劑量組比較，上述兩指標亦有明顯差異（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠海馬組織GAP-43的表達結果見表2。5組大鼠海馬組織GAP-43蛋白和GAP-43mRNA的表達情況：與正常對照組比較，OB損毀組兩者表達略有增高（P＞0.05），與OB損毀組比較，絞股藍皂苷低劑量組兩者表達略有增多（P＞0.05）；而絞股藍皂苷中劑量組明顯增多（P＜0.05）；絞股藍皂苷高劑量組與絞股藍皂苷中劑量組比較，GAP-43蛋白和GAP-43mRNA的表達有明顯差異（P＜0.05）。

表1 各組大鼠Morris水迷宮試驗潛伏期與穿過平臺次數(shù)（±s）

表1 各組大鼠Morris水迷宮試驗潛伏期與穿過平臺次數(shù)（±s）

與OB損毀組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與絞股藍皂苷中劑量組比較，△P＜0.05。下同。

絞股藍皂苷干預前絞股藍皂苷干預結束后潛伏期（s）穿過平臺次數(shù)潛伏期（s）21.41±2.08*9.22±0.89*22.09±1.95* OB損毀組30 3.64±0.36組別n穿過平臺次數(shù)正常對照組30 9.45±0.93* 48.64±4.63 3.53±0.36 49.33±4.83低劑量組30 49.15±4.76 3.48±0.33 47.54±4.69 4.27±0.42中劑量組30 47.97±4.69 3.63±0.31 37.86±3.57*6.35±0.57*高劑量組30 48.82±4.83 3.70±0.40 25.64±2.48△9.11±0.85△

表2 各組大鼠海馬組織GAP-43表達比較（±s）

表2 各組大鼠海馬組織GAP-43表達比較（±s）

組別n ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)正常對照組30 402.95±38.65** OB損毀組30 263.51±25.66低劑量組30 272.73±28.37 GAP-43蛋白GAP-43mRNA 0.682±0.059*0.576±0.054* 0.690±0.067 0.583±0.056 0.707±0.071 0.601±0.061中劑量組30 0.797±0.076*0.694±0.065*332.73±31.54*高劑量組30 0.912±0.090△0.795±0.076△389.70±37.84△

2.3 各組大鼠ChAT陽性細胞計數(shù)結果見表2。在光鏡下觀察染色切片中內(nèi)側隔核和斜角帶垂直支中ChAT免疫陽性神經(jīng)元：與正常對照組比較，OB損毀組ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)明顯減少（P＜0.01），神經(jīng)元胞體和突起明顯萎縮；與OB損毀組比較，絞股藍皂苷低劑量組ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)略有增加（P＞0.05），而絞股藍皂苷中劑量組明顯增多（P＜0.05），且胞體變大、突起變長；絞股藍皂苷高劑量組與絞股藍皂苷中劑量組比較，ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)有明顯差異（P＜0.05）。

3 討論

嗅細胞周圍突突于嗅上皮表面，感受氣味刺激，其中樞突組成嗅神經(jīng)，穿過篩孔進入顱前窩，終止于嗅球。內(nèi)嗅區(qū)不僅接受嗅球的神經(jīng)纖維，還接受同側大腦皮質(zhì)的傳入纖維，并發(fā)出豐富纖維至海馬。海馬功能與短期記憶密切相關，而近記憶缺失正是AD早期臨床表現(xiàn)。因此，嗅覺障礙相當于發(fā)現(xiàn)早期AD的窗口［3-4，10］。

本研究結果顯示，雙側OB損毀，大鼠出現(xiàn)了類似AD的認知功能障礙，這說明本模型較好地模擬了AD學習記憶減退的病理基礎。OB損毀后，嗅束和初、次級嗅皮質(zhì)以及海馬結構的神經(jīng)元和神經(jīng)纖維相繼出現(xiàn)萎縮甚至死亡，影響了學習記憶的結構基礎，導致OB損毀AD模型大鼠學習記憶能力下降。與OB損毀組比較，絞股藍皂苷中、高劑量組潛伏期明顯縮短、穿過平臺次數(shù)明顯增加，表明絞股藍皂苷可以改善OB損毀AD模型大鼠學習記憶能力。

本研究還顯示，絞股藍皂苷可以提高OB損毀AD模型大鼠海馬GAP-43蛋白和GAP-43mRNA表達，這說明OB損毀AD模型大鼠海馬內(nèi)出現(xiàn)了神經(jīng)再生過程，絞股藍皂苷促進了這一過程。在神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)再生過程中，GAP-43在神經(jīng)組織內(nèi)大量合成并在生長錐、軸突及突觸前末梢大量表達。該蛋白可通過加速生長錐基部膜的擴展而促進軸突生長，調(diào)節(jié)生長錐及突觸形態(tài)，參與神經(jīng)元損傷后軸突再生和突觸重建過程，被認為是神經(jīng)元發(fā)育和再生的一個內(nèi)在決定因子，可作為神經(jīng)元損傷后再生的標志［7，10］。

本研究進一步顯示，與OB損毀組比較，絞股藍皂苷中、高劑量組內(nèi)側隔核和斜角帶垂直支中ChAT免疫陽性神經(jīng)元數(shù)明顯增多，且胞體變大、突起變長。這說明絞股藍皂苷對隔區(qū)內(nèi)側隔核和斜角帶核膽堿能神經(jīng)元（是海馬主要傳入纖維來源之一）具有一定的保護作用［4-5，11］；其保護機制是通過穩(wěn)定細胞膜，避免過多的Ca2+內(nèi)流引起超載而對抗了受損神經(jīng)元的變性死亡，還是通過提高膽堿能神經(jīng)元神經(jīng)營養(yǎng)因子受體的敏感性等其他途徑而發(fā)揮作用，尚待進一步研究。

綜上所述，筆者認為，絞股藍皂苷可能通過提高海馬GAP-43蛋白和GAP-43mRNA表達以及保護隔區(qū)內(nèi)側隔核和斜角帶核膽堿能神經(jīng)元，改善OB損毀AD大鼠的學習記憶功能。

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Research of Gypensides on the Learning and Memory Abilities of Ratswith Olfactory Bulb Ablation

HE

ie1，PENGGui-hai1，HUANG Qi2，etal.1 Taihe Hospital，Hubei University of Medicine，Hubei，Shiyan 442000，China；2 Basic Medical College，HubeiUniversity ofMedicine，Hubei，Shiyan 442000，China

Objective：To investigate the effects of gypensides on the learning and memory abilities of rats with olfactory bulb ablation.Methods：SD healthy rats totaling 150 were divided randomly into 5 groups：OB ablation group，high GP dose group，medium GP dose group，low GP dose groups，and control group with 30 rats in each group.The AD ratmodelwas established by bilateral OB ablation.The GPwas imposed on the AD rats by gastric avage.The variations of the behavior，GAP-43 protein levels，GAP-43 mRNA levels and in the septal area the cholineacetytransferase（ChAT）-positive neurons of each group were observed.Results：In comparison with OB ablation group，the latency stages of rats in themedium and high GP dose groups were clearly shortened and the ime of the passages through the platform increased（P＜0.05）.In comparison with OB ablation group，the expresion of GAP-43 protein and GAP-43mRNA were decreased significantly in themedium and high GP dose groups（P＜0.05）.In comparison with the OB ablation group，the ChAT-positive neurons in the medial septal nuclei and vertical branch of diagonal band increased significantly in the rats of themedium and high GP dose groups（P＜0.05），and the nerve cell bodies were enlarged and the neurites were longer.The low GP dose group was not ignificantly different from the OB ablation group in terms of the indicators above（P＞0.05）.Conclusion：GP could promote the expression of GAP-43 protein，GAP-43mRAN and protect the cholinergic neurons in the sepal area，thus improving the learning and memory abilities of AD ratswith OB ablation.

Alzheimer′s disease；Gypensides；Learning and memory abilities；Septal area；Choline acetyltranserase；Cholinergic neurons

R285.5

A

1004-745X（2014）01-0022-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.01.011

湖北省教育廳科研項目（Q20122403）

△通信作者

2013-09-01）