骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)急性肝功能衰竭大鼠肝組織miRNA-155和TNF-α表達(dá)的影響

鄭盛 肖瓊怡 殷芳 郭致平 劉漢屈 王建剛 朱為梅 王玉波

?論著?

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)急性肝功能衰竭大鼠肝組織miRNA-155和TNF-α表達(dá)的影響

鄭盛 肖瓊怡 殷芳 郭致平 劉漢屈 王建剛 朱為梅 王玉波

目的探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）移植對(duì)急性肝功能衰竭（ALF）大鼠肝組織中miRNA-155和TNF-α表達(dá)的影響，以及與BMSCs療效間的關(guān)系。方法將SD大鼠隨機(jī)分為健康對(duì)照組、ALF組、BMSCs治療組和BMSCs預(yù)防組，其中ALF組予以900 mg/kgD-GalN + 10 μg/kg脂多糖腹腔注射建立模型；BMSCs治療組在900 mg/kgD-GalN+10μg/kg脂多糖腹腔注射后2 h，予以尾靜脈注射BMSCs 5.0×106；BMSCs預(yù)防組在900 mg/kgD-GalN + 10 μg/kg脂多糖腹腔注射前予以尾靜脈注射BMSCs 5.0×106；健康對(duì)照組予以0.9﹪氯化鈉溶液1 ml腹腔注射。給藥7 h后每組處死大鼠，檢測(cè)大鼠血清ALT和AST，ELISA法檢測(cè)TNF-α水平，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肝組織miRNA-155、TNF-α mRNA。各組間肝功指標(biāo)差異采用方差分析，同時(shí)觀察每組大鼠的24 h生存率，并用卡方檢驗(yàn)比較各組生存率的差異。結(jié)果D-GalN/脂多糖誘導(dǎo)7 h后，與ALF組相比，BMSCs預(yù)防和BMSCs治療組大鼠ALT、AST、TNF-α水平均有所降低（P< 0.01）；同時(shí)兩組肝組織TNF-α mRNA和miRNA-155表達(dá)水平均有下調(diào)（P< 0.01）；但兩組間相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ALF組大鼠肝組織miRNA-155上調(diào)和TNF-α mRNA誘導(dǎo)呈正相關(guān)（r= 0.734，P= 0.001）。BMSCs預(yù)防組和BMSCs治療組miRNA-155和TNF-α mRNA的部分逆轉(zhuǎn)亦呈正相關(guān)（r值分別為0.687和0.590，P值分別為0.004和0.006）。給藥后24 h，健康對(duì)照組、ALF組、BMSCs治療組和BMSCs預(yù)防組大鼠死亡率組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（c2= 19.078，P< 0.01）。結(jié)論在BMSCs干預(yù)大鼠ALF發(fā)病過程中，可以部分逆轉(zhuǎn)上調(diào)的肝組織miRNA-155和TNF-α，且存在協(xié)同性，提示BMSCs治療ALF可能通過對(duì)肝組織miRNA-155和TNF-α的調(diào)控發(fā)生作用。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；微小核糖核酸；肝功能衰竭，急性；大鼠

急性肝功能衰竭（acute liver failure，ALF）是因肝細(xì)胞大量壞死而出現(xiàn)的嚴(yán)重肝功能障礙，可短期內(nèi)進(jìn)展至肝性腦病，具有病程進(jìn)展快、病死率高、預(yù)后差的特點(diǎn)，其治療仍是世界性難題[1]。原位肝移植是最有效的治療方法，但由于存在供體器官短缺和移植免疫排斥等問題，其臨床應(yīng)用明顯受限。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓內(nèi)的一種非造血干細(xì)胞，既有自我復(fù)制和高度增殖的能力，又有多向分化的潛能，具有來源廣泛、低免疫原性等特點(diǎn)[2]。近年來臨床運(yùn)用BMSCs移植治療終末期肝病取得了良好療效，為臨床解決了肝臟移植、肝細(xì)胞移植、生物人工肝等肝源短缺問題[3]。本研究通過建立大鼠ALF模型，初步探討B(tài)MSCs移植對(duì)ALF大鼠肝組織中miRNA-155和TNF-α表達(dá)的影響，以及與BMSCs療效間的關(guān)系。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠100只，SPF級(jí)，體重130 ～180 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，標(biāo)準(zhǔn)鼠食喂養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作程序經(jīng)過昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、主要試劑

改良Eagle培養(yǎng)基（EMEM）-LG培養(yǎng)液、特級(jí)FBS、胰蛋白酶（美國HyClone公司），D-GalN、脂多糖（美國Sigma公司），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），引物由美國Invitrogen公司合成，大鼠TNF-α的ELISA試劑盒（美國BD公司）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：按參考文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行BMSCs的分離和培養(yǎng)。取第3代BMSCs行流式細(xì)胞術(shù)鑒定，第4代BMSCs經(jīng)胰蛋白酶消化、PBS沖洗，0.9﹪氯化鈉溶液制成細(xì)胞懸液，密度為1.0 × 107/ml，實(shí)驗(yàn)備用。

2.模型的建立：采用隨機(jī)數(shù)字表法將96只SPF級(jí)SD大鼠均分為4組，每組24只。參照文獻(xiàn)[5]的實(shí)驗(yàn)方法，ALF組予以900 mg/kgD-GalN + 10 μg/kg脂多糖腹腔注射建立模型；BMSCs治療組在900 mg/kgD-GalN + 10 μg/kg脂多糖腹腔注射后2 h，予以尾靜脈注射BMSCs 5.0 × 106；BMSCs預(yù)防組在900 mg/kgD-GalN+10 μg/kg脂多糖腹腔注射前予以尾靜脈注射BMSCs 5.0 ×106；健康對(duì)照組予以0.9﹪氯化鈉溶液1 ml腹腔注射。在給藥7 h后每組處死大鼠12只，留取大鼠血清和肝臟組織標(biāo)本，其中血清標(biāo)本-20℃保存，肝臟組織在液氮中預(yù)冷后轉(zhuǎn)移至-70℃低溫保存。余下每組12只大鼠觀察24 h生存率。

3.大鼠血清ALT和AST檢測(cè)：由全自動(dòng)生化分析儀完成檢測(cè)。

4.ELISA法檢測(cè)大鼠血清TNF-α水平：在預(yù)包被的反應(yīng)板中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)血清各100 μl，37℃溫浴120 min；洗滌后加入兔抗大鼠TNF-α抗體，37℃溫浴60 min；加羊抗兔IgGHRP標(biāo)記抗體，37℃溫浴120 min；加入底物，置37℃避光反應(yīng)5 ～ 10 min；加入終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀在492 nm處測(cè)吸光度（A）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取各待測(cè)標(biāo)本含量。

5.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)大鼠肝組織TNF-α mRNA和miRNA-155的表達(dá)：具體方法參照文獻(xiàn)[6]。TNF-α mRNA檢測(cè)以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參照，miRNA-155的表達(dá)以U6為內(nèi)參照。結(jié)果用2-△△Ct表示。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間均數(shù)有Two-Way ANOVA方差分析，生存分析采用R×C c2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson和Spearman相關(guān)分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

原代培養(yǎng)3 d后，鏡下可見細(xì)胞呈單個(gè)或少量貼壁生長，多呈短梭形；7 ～ 10 d后，細(xì)胞不斷擴(kuò)大并融合成單層，多呈長梭形或多角形；傳至第3、4代，鏡下可見細(xì)胞形態(tài)和胞質(zhì)透光性均良好，類似成纖維細(xì)胞，呈漩渦狀生長。流式細(xì)胞術(shù)鑒定示第3代細(xì)胞表面表達(dá)CD90+CD45-的細(xì)胞占總細(xì)胞的比例> 95﹪，表明第3代細(xì)胞為BMSCs。

二、各組大鼠24 h存活情況比較

給藥后24 h，健康對(duì)照組、ALF組、BMSCs治療組和BMSCs預(yù)防組各死亡0/12、10/12、6/12和3/12只，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（c2= 19.078，P< 0.01）。

三、BMSCs對(duì)各組大鼠血清ALT、AST、TNF-α的影響

D-GalN/脂多糖誘導(dǎo)7 h后，健康對(duì)照組、ALF組、BMSCs治療組和BMSCs預(yù)防組大鼠血清ALT、AST、TNF-α組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P< 0.01）；BMSCs預(yù)防組和BMSCs治療組血清ALT、AST、TNF-α水平均較ALF組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P< 0.01），（表1）。

四、BMSCs對(duì)各組大鼠肝組織TNF-α mRNA、miRNA-155表達(dá)的影響

D-GalN/脂多糖誘導(dǎo)7 h后，健康對(duì)照組、ALF組、BMSCs治療組和BMSCs預(yù)防組大鼠肝組織TNF-α mRNA、miRNA-155表達(dá)組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P< 0.01）；與ALF組相比，BMSCs預(yù)防組和BMSCs治療組肝組織TNF-α mRNA、miRNA-155表達(dá)水平均有下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P< 0.01），（表2）。

五、大鼠miRNA-155和TNF-α表達(dá)水平的相關(guān)性

D-GalN/脂多糖誘導(dǎo)7 h后，ALF組大鼠肝組織miRNA-155上調(diào)和TNF-α mRNA誘導(dǎo)呈正相關(guān)（r= 0.734，P= 0.001）。BMSCs預(yù)防組和BMSCs治療組miRNA-155和TNF-α mRNA的部分逆轉(zhuǎn)亦呈正相關(guān)（r值分別為0.687和0.590，P值分別為0.004和0.006）。

表1 BMSC對(duì)各組大鼠血清ALT、AST、TNF-α的影響

討 論

ALF時(shí)由于對(duì)內(nèi)毒素滅活功能下降，存在內(nèi)毒素血癥，其重要成分脂多糖可被宿主TLR4識(shí)別并結(jié)合，引起炎性級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，通過多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起巨噬細(xì)胞分泌致炎細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致炎性反應(yīng)的發(fā)生[7]，而過度的免疫炎性反應(yīng)同時(shí)導(dǎo)致了大量肝細(xì)胞凋亡和壞死，最終導(dǎo)致肝功能衰竭的發(fā)生。

表2 BMSC對(duì)各組大鼠肝組織TNF-α mRNA、miRNA-155表達(dá)的影響

BMSCs是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，研究證實(shí)，BMSCs不僅可分化成為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，且在肝臟微環(huán)境中BMSCs可分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，參與肝細(xì)胞的修復(fù)和重構(gòu)，從而達(dá)到改善肝功能的目的[8]。此外，BMSCs能體外抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、DC、NK細(xì)胞等活化和增殖，減少炎性細(xì)胞因子分泌[9]。Li等[10]用人骨髓來源MSC門靜脈灌注D-GalN誘導(dǎo)的ALF小型豬，發(fā)現(xiàn)能顯著延長生存時(shí)間，改善肝功能，肝組織免疫組織化學(xué)顯示，移植后2 ～ 10周肝小葉和肝實(shí)質(zhì)可見約30﹪人源MSC分化的肝細(xì)胞，且無明顯免疫排斥反應(yīng)，至15周人肝細(xì)胞顯著減少，至20周僅散在分布，肝組織結(jié)構(gòu)幾乎恢復(fù)正常，與此同時(shí)血清人白蛋白出現(xiàn)相應(yīng)的變化，移植后10周升至最高，后逐漸下降，提示BMSCs分化為肝細(xì)胞起重要作用，同時(shí)可能存在BMSCs的免疫抑制作用。

研究[11]證實(shí)，ALF小鼠肝組織miRNA表達(dá)譜出現(xiàn)明顯變化，且隨肝臟炎性反應(yīng)的加重以及肝細(xì)胞損傷而加劇，尤其是與免疫炎性反應(yīng)相關(guān)的miRNA-155和miRNA-146a表達(dá)上調(diào)明顯。Baltimore等[12]發(fā)現(xiàn)miRNA具有組織特異性，miRNA-155主要表達(dá)于免疫細(xì)胞，與巨噬細(xì)胞、DC、NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等細(xì)胞分化和功能相關(guān)。本研究選擇檢測(cè)D-GalN/脂多糖誘導(dǎo)7 h后大鼠肝組織miRNA-155和TNF-α mRNA，理由為：（1）D-GalN/脂多糖誘導(dǎo)的ALF病情進(jìn)展快，前期的研究[13]提示，D-GalN/脂多糖誘導(dǎo)后5 h肝組織病理提示開始出現(xiàn)壞死，7 h比較典型，9 h后大片壞死，所以為了更準(zhǔn)確檢測(cè)，本研究標(biāo)本選擇時(shí)間在誘導(dǎo)7 h；（2）BMSCs靜脈注入ALF大鼠，達(dá)到治療效果需要一段時(shí)間，尤其是BMSCs治療組，BMSCs是在D-GalN/脂多糖誘導(dǎo)后2 h靜脈輸入，為更好地觀察療效，標(biāo)本選擇時(shí)間最好在誘導(dǎo)2 h后更長時(shí)間。

本研究結(jié)果提示，BMSCs干預(yù)能部分逆轉(zhuǎn)ALF大鼠肝組織miRNA-155?？赡茉?yàn)椋海?）miRNA-155為免疫細(xì)胞相關(guān)性miRNA，肝細(xì)胞內(nèi)豐度極低，BMSCs可通過減少肝組織免疫細(xì)胞（庫普弗細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等）浸潤來下調(diào)肝組織miRNA-155；（2）BMSCs可直接通過抑制免疫細(xì)胞活化和下調(diào)免疫細(xì)胞miRNA-155來下調(diào)肝組織miRNA-155。進(jìn)一步相關(guān)分析顯示，ALF大鼠肝組織miRNA-155上調(diào)和TNF-α mRNA誘導(dǎo)呈正相關(guān)，且BMSCs干預(yù)后，miRNA-155和TNF-α mRNA的部分逆轉(zhuǎn)也呈正相關(guān)。Tili等[14]研究顯示，脂多糖體外刺激鼠264.7巨噬細(xì)胞TNF-α上調(diào)的同時(shí)，導(dǎo)致miRNA-155表達(dá)上調(diào)。單獨(dú)予以TNF-α刺激巨噬細(xì)胞，可以依賴細(xì)胞核因子-ΚB的方式瞬時(shí)導(dǎo)致miRNA-155表達(dá)上調(diào)，機(jī)制可能與核因子-ΚB有關(guān)。Rodriguez等[15]和Thai等[16]用脂多糖刺激miRNA-155基因敲除小鼠B淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TNF-α表達(dá)下降，且這種影響主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，說明miRNA-155能以增加TNF-α mRNA穩(wěn)定性方式促進(jìn)TNF-α表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，ALF大鼠肝組織miRNA-155和TNF-α相互促進(jìn)，可能參與ALF發(fā)病機(jī)制，經(jīng)過BMSCs的預(yù)處理或同時(shí)處理，可以降低ALF時(shí)升高的肝組織miRNA-155和TNF-α，可能是BMSCs治療ALF有效的機(jī)制之一，但其確切的機(jī)制仍有待于進(jìn)一步深入研究。

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Effects of bone marrow mesechymal stem cells on microRNA-155 and tumor necrosis factor alpha expression in liver tissue of rats with acute liver failure

Zheng Sheng,Xiao Qiongyi,Yin Fang,Guo Zhiping,Liu Hanqu,Wang Jiangang,Zhu Weimei,Wang Yubo.Department of Liver Diseases,Yunnan The third People’s Hospital,Kunming 650011,China

Zheng Sheng,Email: zheng_sheng523@163.com

ObjectiveTo explore the effects of bone mesenchymal stem cells (BMSCs) on the microRNA-155 (miRNA-155) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) expression in liver tissue of rats with acute liver failure (ALF),and to explore the relationship between miRNA-155/TNF-α and the efficacy of BMSCs.MethodsSD rats were randomly divided into four groups,including control group,ALF group,BMSC treatment group and BMSC pretreatment group.Rats in each group were sacrificed 7 h after intraperitonealD-GalN/ LPS administration.Liver function,serum TNF-α level,miRNA-155 and TNF-α mRNA ofliver tissue were detected subsequently.Survival rate at 24 h was observed in each group.Results Seven hours afterD-GalN/LPS induction,alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase levels of BMSC treatment and BMSC pretreatment groups were significantly lower when compared with those of ALF group(allP< 0.01).Compared with ALF group,serum levels of TNF-α decreased in BMSC treatment and BMSC pretreatment groups and the difference was statistically significant (allP< 0.01).The difference of the TNF-α mRNA expression in liver tissue between groups was statistically significant (F= 72.24,P< 0.01).The TNF-α mRNA and miRNA-155 expression of BMSC treatment and BMSC pretreatment groups were down-regulated in comparison with ALF group,which showed statistical difference (allP< 0.01).The positive correlation between miRNA-155 and TNF-α mRNA in liver tissue was confirmed in ALF group (r= 0.734,P= 0.001),BMSC treatment (r= 0.590,P= 0.006) and BMSCs pretreatment (r= 0.687,P= 0.004).24 h afterD-GalN/LPS administration,the difference of mortalities between groups was statistically significant (χ2=19.078,P< 0.01).ConclusionWith BMSC intervention in ALF,up-regulated miRNA-155 and TNF-α expressions in liver tissue could be partially reversed by BMSCs,suggesting that BMSC alleciate ALF via regulating miRNA-155 and TNF-α.

Bone mesenchymal stem cells；MicroRNAs；Liver failure,acute；Rat

2014-03-04)

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2014.02.001

云南省自然科學(xué)基金（2012FD095）

650011 昆明，云南省第三人民醫(yī)院肝病中心

鄭盛，Email:zheng_sheng523@163.com

鄭盛,肖瓊怡,殷芳,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)急性肝功能衰竭大鼠肝組織微小核糖核酸-155和腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志:電子版,2014,4(2):79-83.