超聲結(jié)合蘋果酸處理對雙孢蘑菇多酚氧化酶活性及失活動力學(xué)的影響

周 磊 劉 偉 熊志強(qiáng) 鄒立強(qiáng) 方志超

ZHOU Lei LIU Wei XIONG Zhi－qiang ZOU Li－qiangFANG Zhi－chao

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330047，China）

多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）普遍存在于植物、真菌及昆蟲的質(zhì)體中，是自然界中分布極廣的一種氧化還原酶，PPO在植物細(xì)胞組織中的位置會因原料的品種、種類及成熟度的不同而存在差異［1，2］。由PPO誘導(dǎo)的酶促反應(yīng)使果蔬在貯藏、運(yùn)輸及加工過程中發(fā)生褐變反應(yīng)，褐變反應(yīng)在很大程度上影響果蔬的營養(yǎng)及感官等各種品質(zhì)。因此，抑制褐變反應(yīng)在果蔬貯藏、運(yùn)輸過程中十分的重要。

對PPO進(jìn)行改性一直是PPO研究的熱點，其中主要的應(yīng)用手段有：化學(xué)方法（如添加亞硫酸鹽［3］、有機(jī)酸［4，5］等）；物理方法（如熱處理［6，7］、脈沖電場［8］、靜高壓［9］）等；多種處理手段結(jié)合使用的方法（如超聲結(jié)合熱處理［10］、高壓與溫度相結(jié)合［11］、抗壞血酸結(jié)合熱處理［12］等）。在本課題組先前的研究中利用了動態(tài)高壓微射流［13，14］對PPO進(jìn)行處理。目前，關(guān)于有機(jī)酸單獨處理對PPO活性影響的報道較多，顧林等［4］研究發(fā)現(xiàn)抗壞血酸及檸檬酸能有效抑制山藥PPO的活性，趙東海等［5］報道了半胱氨酸及抗壞血酸對蘑菇PPO具有較強(qiáng)的抑制效果。本課題組研究報道了檸檬酸對蘑菇PPO的抑制效果，PPO經(jīng)60 mmol／L的檸檬酸處理后基本失活［15］。超聲作為一種非熱手段在食品行業(yè)有著廣泛運(yùn)用，有許多研究報道了超聲結(jié)合其它手段處理PPO，如Cheng等［10］運(yùn)用超聲結(jié)合熱處理對PPO失活動力學(xué)進(jìn)行研究，Ba?lar等［16］研究了超聲結(jié)合紫外對蘋果汁PPO活性的影響。蘋果酸與超聲結(jié)合對PPO活性及失活動力學(xué)的研究則還沒有報道，蘋果酸作為一種有機(jī)酸存在于許多果蔬中，在食品行業(yè)中常作為酸味調(diào)節(jié)劑來使用，因此，超聲結(jié)合蘋果酸的運(yùn)用在工業(yè)上具有一定的可行性。

本試驗以雙孢蘑菇PPO為原料，首先用不同濃度的蘋果酸對蘑菇PPO進(jìn)行處理，測定處理后PPO的相對活性。選取中等濃度的蘋果酸結(jié)合超聲對PPO進(jìn)行處理，測定中等濃度的蘋果酸結(jié)合超聲處理對PPO活性的影響，計算失活速率常數(shù) （k）、D 值及半衰期（t1／2）的變化。本研究為更好的利用蘋果酸及超聲抑制PPO的活性提供理論基礎(chǔ)，對控制果蔬的酶促褐變具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇PPO：活性700 U／mg，美國 Worthington Biochemical公司；

蘋果酸：分析純，阿拉丁試劑上海有限公司；

鄰苯二酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波細(xì)胞破碎儀：JY88－II型，寧波新芝生物科技有限公司；

紫外光譜儀：PC－1600型，上海美譜達(dá)公司。

1.3 方法

1.3.1 PPO活性的測定 參照Liu等［14］的方法，反應(yīng)底物共2.9 m L，其中含2.7 m L 50 mmol／L、p H 6.8的磷酸緩沖溶液與0.2 m L 2 mmol／L的鄰苯二酚溶液，反應(yīng)前將底物溶液在水浴鍋中于37℃下恒溫20 min。取酶液0.1 m L與底物混合，立即于420 nm波長下測定反應(yīng)5 min前后其吸光度的變化。

酶活力的定義：每分鐘內(nèi)每毫升酶液于420 nm波長處吸光度變化0.001定義為1個酶活力單位。相對活性的定義見式（1）。

1.3.2 蘋果酸對PPO溶液的處理 稱取不同質(zhì)量的蘋果酸，分別用10 m L 50 mmol／L、p H 6.8的磷酸緩沖液溶解成濃度為20，30，40，50，60，80，100，120 mmol／L 的蘋果酸溶液。稱取20.00 mg PPO，將其溶解于100 m L 50 mmol／L磷酸緩沖液（p H 6.8）配制成0.2 mg／m L PPO 溶液。分別取10 m L不同濃度的蘋果酸溶液與10 m L PPO溶液混合，最后PPO的濃度為0.1 mg／m L，蘋果酸的最終濃度分別為10，15，20，25，30，40，50，60 mmol／L。處理20 min后測定不同濃度的蘋果酸對PPO活性的影響。

1.3.3 超聲對PPO溶液的處理 稱取2 mg PPO溶解于20 m L 50 mmol／L磷酸緩沖液（p H 6.8）配制成0.1 mg／m L PPO溶液，立即將超聲波細(xì)胞破碎儀的探針置于裝有PPO溶液的燒杯中，于冰浴條件下進(jìn)行超聲處理，探針伸入液面3 cm。超聲頻率為25 k Hz，功率為250 W，超聲時間分別為10，20，30，40，50，60 min。

1.3.4 超聲結(jié)合蘋果酸對PPO溶液的處理 選取中等濃度的蘋果酸（15，20，25 mmol／L）結(jié)合超聲對PPO進(jìn)行處理：按方法1.3.2得到中等濃度蘋果酸（15，20，25 mmol／L）處理后的20 m L PPO溶液，立即將超聲波細(xì)胞破碎儀的探針置于裝有PPO溶液的燒杯中，于冰浴條件下進(jìn)行超聲處理，探針伸入液面3 cm。超聲頻率為25 k Hz，功率為250 W，超聲時間分別為10，20，30，40，50，60 min。

1.3.5 失活動力學(xué)的分析 酶的失活動力學(xué)可用一級方程進(jìn)行表達(dá)：

式中：

At—— 樣品經(jīng)過t min處理后的相對酶活，U／min；

t—— 處理的時間，min；

k—— 失活速率常數(shù)，min－1。

可將上述一級反應(yīng)方程式轉(zhuǎn)變成式（3）：

式中：

A0—— 原酶活，U／min。

可根據(jù)上述式（3），以t為橫坐標(biāo)，相對酶活的對數(shù)ln（At／A0）為縱坐標(biāo)作出失活曲線圖，并通過曲線斜率計算出各濃度蘋果酸結(jié)合超聲處理PPO的失活速率常數(shù)（k）。

可通過式（4）、（5）分別計算出半衰期t1／2和10倍減少時間D值。

式中：

t1／2—— 酶失活50% 所需的時間，min；

D——酶失活90%所需時間，min。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析及處理 每個試驗重復(fù)3次，取平均值。用SAS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度蘋果酸處理對PPO相對活性的影響

由圖1可知，PPO相對活性隨著蘋果酸濃度的增加逐漸下降，蘋果酸濃度低于25 mmol／L時PPO活性變化較小；蘋果酸濃度為30，40，50 mmol／L時PPO受到比較明顯的抑制。當(dāng)蘋果酸濃度達(dá)到60 mmol／L時PPO活性受到強(qiáng)烈抑制。由此可見高濃度的蘋果酸對蘑菇PPO的抑制效果比較明顯。

圖1 不同濃度的蘋果酸對PPO相對酶活性的影響Figure 1 Effect of malic acid on relative activity of PPO

于新等［17］研究發(fā)現(xiàn)100 mg／L的蘋果酸、檸檬酸、酒石酸可有效抑制草菇PPO的活性，李曉莉等［18］報道了0.1 mol／L的L－抗壞血酸、檸檬酸及蘋果酸對山藥PPO具有抑制作用，但蘋果酸的抑制效果比L－抗壞血酸及檸檬酸弱一些。本課題組先前研究［15］發(fā)現(xiàn)蘑菇PPO經(jīng)60 mmol／L的檸檬酸處理后其相對活性僅剩4.3%，這比本研究中60 mmol／L的蘋果酸對蘑菇PPO的抑制效果更加明顯。由此可見，有機(jī)酸對PPO相對活性的影響與PPO的來源、有機(jī)酸的種類及濃度有關(guān)。

2.2 超聲結(jié)合蘋果酸對PPO活性的影響

由圖2可知，PPO經(jīng)30 min超聲處理后其相對活性保持在90%以上，經(jīng)60 min超聲處理后其相對活性仍有81.8%，由此可見單獨超聲對PPO活性的影響較小，抑制效果不明顯；PPO經(jīng)15 mmol／L蘋果酸處理30 min后其相對活性為86.6%，之后隨時間的變化比較緩慢，經(jīng)60 min處理后，抑制效果也不明顯。超聲結(jié)合15 mmol／L蘋果酸的處理對PPO活性影響較大，PPO相對活性隨處理時間的增長不斷下降。處理60 min后其相對活性為40.6%；超聲結(jié)合20 mmol／L蘋果酸對PPO的抑制效果明顯；PPO 經(jīng)25 mmol／L蘋果酸處理60 min后，顯示出一定的抑制作用，但與超聲結(jié)合處理60 min后PPO完全失活。超聲結(jié)合25 mmol／L蘋果酸對PPO具有強(qiáng)烈的抑制作用。

單獨使用超聲或中等濃度（15，20，25 mmol／L）蘋果酸對蘑菇PPO的抑制效果均不明顯，但超聲與蘋果酸結(jié)合處理則能使PPO活性得到明顯的抑制。Cheng等［10］報道超聲結(jié)合熱處理對PPO的抑制效果明顯強(qiáng)于單獨超聲或單獨熱處理對PPO的抑制作用。Jang等［19］報道利用超聲結(jié)合抗壞血酸處理蘋果鮮切片，其PPO在鮮切片的儲藏過程中受到更加顯著的抑制。Ba?lar等［16］則報道了超聲結(jié)合紫外處理對PPO的抑制效果更加明顯。超聲對PPO具有抑制作用可能是因為聲激波產(chǎn)生強(qiáng)大的剪切力破壞了蛋白質(zhì)多肽鏈上的氫鍵及范德華力［20］。

圖2 超聲結(jié)合蘋果酸處理對PPO活性的影響Figure 2 Effect of combing ultrasound with malic acid on activity of polyphenol oxidase

2.3 超聲結(jié)合蘋果酸對PPO失活動力學(xué)的影響

由圖3可知，經(jīng)超聲以及超聲結(jié)合中等濃度蘋果酸處理后的PPO的失活動力學(xué)符合一級動力學(xué)方程，相關(guān)系數(shù)R2如表1所示，范圍為0.934～0.971。由圖3得到各曲線的斜率從而得出失活速率常數(shù)（k），進(jìn)而計算得到超聲結(jié)合各濃度的蘋果酸處理PPO的D值及半衰期t1／2。由表1可知，單獨超聲處理的PPO的k 值為0.33×10－2min－1，超聲與蘋果酸結(jié)合處理后其失活速率常數(shù)隨蘋果酸濃度的增加而變大，其中25mmol／L的蘋果酸所對應(yīng)的k值達(dá)到4.36×10－2min－1，這與單獨超聲相比具有明顯的升高。超聲與蘋果酸結(jié)合處理后PPO的D值明顯變小，蘋果酸濃度越高D值越小，當(dāng)蘋果酸的濃度為0，25 mmol／L時D 值分為690.9，52.6 min。半衰期t1／2隨蘋果酸濃度的升高也逐漸變小，當(dāng)蘋 果 酸 的 濃 度 為0，25 mmol／L 時t1／2分 別 為208，15.9 min。

圖3 超聲結(jié)合蘋果酸處理PPO的失活曲線Figure 3 Inactivation curve of PPO treated with the combination of malic acid and ultrasound

表1 超聲結(jié)合蘋果酸處理PPO的k值、D值、t 1／2Table 1 The value of k、D、t 1／2 of PPO treated with the combination of malic acid and ultrasound

有研究［10］報道超聲結(jié)合熱處理PPO與單獨超聲或單獨熱處理相比，其失活速率常數(shù)k明顯增大，且其k值隨熱處理溫度的升高而變大，D值及半衰期t1／2則隨熱處理溫度的升高而變小，這與本研究結(jié)果相似。由此可見，單獨超聲對PPO的抑制效果較弱，但與其它處理手段相結(jié)合可起到明顯的抑制效果。

3 結(jié)論

隨著蘋果酸濃度的增加，PPO的相對活性逐漸降低，當(dāng)蘋果酸濃度達(dá)到60 mmol／L時，PPO基本完全失活，其酶活性僅為9.1%。單獨的超聲處理和中等濃度的蘋果酸處理對PPO抑制效果并不是很明顯。但是超聲結(jié)合中等濃度的蘋果酸處理能夠顯著的降低PPO酶活性。如分別經(jīng)單獨超聲處理、20 mmol／L蘋果酸處理和超聲結(jié)合20 mmol／L蘋果酸處理60 min后PPO 活性分別為81.8%，79.7%，12.6%。超聲結(jié)合中等濃度蘋果酸處理PPO失活過程均符合一級動力學(xué)方程，且失活速率常數(shù)（k）隨著酸濃度的增加而增大，當(dāng)蘋果酸濃度分別為0，25 mmol／L時，其失活速率常數(shù) （k）為0.33×10－2，4.36×10－2min－1。同時 D 值、半衰期（t1／2）隨著蘋果酸濃度增大而變小并且明顯低于單獨超聲處理的PPO，當(dāng)蘋果酸濃度分別為0，25 mmol／L時，其D 和t1／2分別為690.9，208.0 min和52.6，15.9 min。

1 García S C，Buzaleh A M.Polyphenoloxidase：An enzyme widespread in fruits［J］.Biochemical Education，1994，22（3）：152～153.

2 Dicko M H，Hilhorst R，Gruppen H，et al.Comparison of content in phenolic compounds，polyphenol oxidase，and peroxidase in grains of fifty sorghum varieties from Burkina Faso［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（13）：3 780～3 788.

3 Zhao Z，Zhu L，Yu S，et al.Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from sugarcane（Saccharum officinarum L.）［J］.Zuckerindustrie，2011，136（5）：296～301.

4 顧林，魯茂林，姜軍，等.山藥多酚氧化酶酶學(xué)特性及褐變控制研究 ［J］.食品與機(jī)械，2006，22（6）：26～29.

5 趙東海，張建平，侯菊花.蘑菇中多酚氧化酶的酶學(xué)特性研究［J］.食品與機(jī)械，2004，20（5）：12～13.

6 Gouzi H，Depagne C，Coradin T.Kinetics and thermodynamics of the thermal inactivation of polyphenol oxidase in an aqueous extract from Agaricus bisporus［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60（1）：500～506.

7 Chutintrasri B，Noomhorm A.Thermal inactivation of polyphenoloxidase in pineapple puree［J］.LWT－Food Science and Technology，2006，39（5）：492～495.

8 Zhong K，Wu J，Wang Z，et al.Inactivation kinetics and secondary structural change of PEF－treated POD and PPO［J］.Food Chemistry，2007，100（1）：115～123.

9 Yi J，Jiang B，Zhang，et al.Effect of ultrahigh hydrostatic pressure on the activity and structure of mushroom（Agaricus bisporus）polyphenoloxidase［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60（2）：593～599.

10 Cheng X，Zhang M，Adhikari B.The inactivation kinetics of polyphenol oxidase in mushroom（Agaricus bisporus）during thermal and thermosonic treatments［J］.Ultrasonics sonochemistry，2013，20（2）：674～679.

11 Weemaes C A，Ludikhuyze L R，Van den Broeck I，et al.Kinetics of combined pressure－temperature inactivation of avocado polyphenoloxidase［J］.Biotechnology and Bioengineering，1998，60（3）：292～300.

12 Chow Y N，Louarme L，Bonazzi C，et al.Apple polyphenoloxidase inactivation during heating in the presence of ascorbic acid and chlorogenic acid［J］.Food Chemistry，2011，129（3）：761～767.

13 Liu W，Liu J，Xie M，et al.Characterization and high－pressure microfluidization－induced activation of polyphenoloxidase from Chinese pear（Pyrus pyrifolia Nakai）［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（12）：5 376～5 380.

14 Liu W，Liu J，Liu C，et al.Activation and conformational changes of mushroom polyphenoloxidase by high pressure microfluidization treatment［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2009，10（2）：142～147.

15 Liu W，Zou L，Liu J，et al.The effect of citric acid on the activity，thermodynamics and conformation of mushroom polyphenoloxidase［J］.Food Chemistry，2013，140（1～2）：289～295.

16 Ba?lar M，Ertugay M F.The effect of ultrasound and photosonication treatment on polyphenoloxidase （PPO）activity，total phenolic component and colour of apple juice［J］.InternationalJournal of Food Science ＆ Technology，2013，48（4）：886～892.

17 于 新，馮 彤，李遠(yuǎn)志，等.食品添加劑對草菇PPO和POD活性的影響［J］.食品工業(yè)科技，2002，23（5）：10～13.

18 李曉莉，沈金玉，黃家音.山藥多酚氧化酶特性研究［J］.精細(xì)化工，2005，22（7）：527～529.

19 Jang J H，Kim S T，Moon K D.Inhibitory effects of ultrasound in combination with ascorbic acid on browning and polyphenol oxidase activity of fresh－cut apples［J］.Food Science and Biotechnology，2009，18（6）：1 417～1 422.

20 Feng H，Barbosa－Caanovas G V，Weiss J，et al.Ultrasound technologies for food and bioprocessing ［M］.New York：Springer，2011：369～404.