前列腺癌組織BSP表達(dá)與骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)性探討

余書勇，朱其聰，毛高才，呂 揚，王亞輝，楊 琳

（中國人民解放軍第187醫(yī)院腫瘤中心1、病理科2、檢驗科3，海南 ?？?571159）

前列腺癌組織BSP表達(dá)與骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)性探討

余書勇1，朱其聰1，毛高才2，呂 揚3，王亞輝1，楊 琳1

（中國人民解放軍第187醫(yī)院腫瘤中心1、病理科2、檢驗科3，海南 海口 571159）

目的探討前列腺癌(PCa)組織中骨唾液酸蛋白(BSP)的表達(dá)與骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法收集2006年1月1日至2013年6月30日間我院收治的PCa患者68例，以良性前列腺增生（BPH）患者22例作為對照組，采用免疫組織化學(xué)SP法檢測PCa或前列腺增生組織BSP表達(dá)，并結(jié)合腫瘤的病理學(xué)行為和臨床隨訪資料進(jìn)行分析。結(jié)果PCa組織的BSP表達(dá)陽性率為76.47%，顯著高于BPH組織的13.64%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。PCa組織的BSP表達(dá)與腫瘤病理分期(χ2=9.338，P=0.009)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(χ2=6.38，P=0.012)密切相關(guān)，而與患者年齡(χ2= 0.593，P=0.441)、病理分級(χ2=0.057，P=0.972)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=0.126，P=0.722)均無相關(guān)。52例BSP表達(dá)陽性的PCa患者術(shù)前血清總前列腺特異性抗原(tPSA)含量為(69.06±25.52)μg/L，16例BSP陰性患者血清tPSA含量為(38.00±21.64)μg/L，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=19.355，P＜0.001)。BSP表達(dá)陽性的PCa患者骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率(71.15%，37/52)高于BSP陰性患者(25.0%，4/16)(χ2=10.887，P=0.001)。結(jié)論前列腺癌BSP表達(dá)與其骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其有可能作為預(yù)測PCa骨轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。

PCa；骨唾液酸蛋白；骨轉(zhuǎn)移；免疫組織化學(xué)

前列腺癌(Prostate cancer，PCa)在疾病發(fā)展過程中有65%～75%的患者將發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，但有約80%的骨轉(zhuǎn)移患者因無臨床表現(xiàn)而影響了早期診斷。目前診斷PCa骨轉(zhuǎn)移主要是根據(jù)影像學(xué)檢查，缺乏有效的骨轉(zhuǎn)移生化標(biāo)志物。近年來，骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein，BSP)作為新的骨代謝標(biāo)志物在骨轉(zhuǎn)移癌早期診斷中得到廣泛研究。本研究旨在探討B(tài)SP在PCa中的表達(dá)與骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以期對高危人群予以預(yù)防性治療，防治骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，從而降低PCa骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，提高患者的生活質(zhì)量。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2006年1月1日至2013年6月30日間我院前列腺根治手術(shù)摘除或者經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)切除，經(jīng)病理檢查證實為PCa的蠟塊標(biāo)本68例。患者均為初治者，術(shù)前未經(jīng)內(nèi)分泌治療或放療，年齡46～81歲，中位年齡65歲。病理分級采用2005年國際泌尿病理協(xié)會修訂的Gleason分級系統(tǒng)，其中分化良好癌16例，中等分化癌40例，分化不良癌12例。病理分期按國際TNM(AJCC，2002年)分期標(biāo)準(zhǔn)，其中pT2 37例，pT3 21例，pT4 10例。選取我院同期手術(shù)切除的良性前列腺增生(Benign prostatic yperplasia，BPH)組織蠟塊標(biāo)本22例作為對照，患者年齡47～75歲，中位年齡64歲。68例PCa患者術(shù)后隨訪6個月～6年，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移47例；其中骨轉(zhuǎn)移41例，無骨轉(zhuǎn)移27例。

1.2 主要儀器與試劑 主要試劑：兔抗人單克隆BSP抗體(濃縮液)購自英國Abcam公司，即用型SP試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，濃縮型DAB顯色試劑盒(20X)購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。主要儀器：OlympysCX31光學(xué)顯微鏡，日本Olympys公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 BSP檢測實驗步驟 采用SP二步法進(jìn)行BSP的免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育20 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗5 min×2次，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(即抗原修復(fù)液)的抗原修復(fù)盒中，微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)20 min，冷卻至室溫。PBS沖洗5 min×2次。滴加兔抗人單克隆BSP抗體(一抗)，工作濃度：l: 300，4℃過夜；次日PBS沖洗，5 min×3次；滴加即用型酶標(biāo)羊抗兔IgG聚合物(二抗)，37℃孵育25 min；PBS沖洗，5 min×3次。DAB顯色劑(工作液)顯色。自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。對照染色：以已知BSP的陽性切片作為對照，以0.0l mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為每次染色的陰性對照。

1.3.2 血清總前列腺特異性抗原(tPSA)測定 清晨空腹采集外周血，分離血清置-20℃保存待測。采用電化學(xué)發(fā)光法檢測PCa患者術(shù)前血清tPSA的含量。tPSA試劑盒購自德國Roche Diagnostic GmbH公司，按說明書進(jìn)行操作。

1.4 研究方法 采用實驗法來探討前列腺癌BSP表達(dá)及其與骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1.5 結(jié)果判定 每張切片觀察5個高倍視野，BSP表達(dá)陽性細(xì)胞染色為胞漿明顯棕黃或棕褐色，陽性細(xì)胞數(shù)≤25%為陰性；25%～80%為弱陽性(+)；≥80%為強(qiáng)陽性(++)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行多組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BSP在PCa與BPH組織中的表達(dá)情況 68例PCa石蠟標(biāo)本切片后，常規(guī)SP法免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)52例(76.47%)標(biāo)本均有+～++的陽性染色，染色部位主要位于癌細(xì)胞胞漿，大多數(shù)為均質(zhì)性(見圖1)，也有少數(shù)為顆粒狀(見圖2)，而周邊正常腺組織無或低表達(dá)BSP(見圖3)。22例BPH患者標(biāo)本中有3例(13.64%)呈低表達(dá)BSP，其余均無表達(dá)BSP。BSP表達(dá)率在PCa與BPH間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 27.614，P＜0.001)。

圖3 BSP染色呈陰性（SP×400）

2.2 PCa組織中BSP的表達(dá)及其與年齡、病理分級、病理分期、轉(zhuǎn)移、血清tPSA的關(guān)系 68例PCa組織中，BSP表達(dá)率與年齡、病理分級、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P＞0.05)；而與病理分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜ 0.05)，見表1。52例BSP陽性表達(dá)的PCa患者術(shù)前血清tPSA含量為(69.06±25.52)μg/L，16例BSP陰性患者血清tPSA含量為(38.00±21.64)μg/L，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=19.355，P＜0.001)。

表1 BSP在PCa組織中的表達(dá)及其與臨床有關(guān)參數(shù)的相關(guān)性（例）

2.3 BSP表達(dá)與骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系 52例BSP表達(dá)陽性的PCa患者骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率為71.15%，16例BSP陰性患者骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率為25.0%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.887，P=0.001)。

3 討論

PCa是最易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤之一，死于PCa的患者中85%～100%合并骨轉(zhuǎn)移。據(jù)統(tǒng)計局限性無轉(zhuǎn)移的PCa患者90%生存期可超過10年，而發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后生存期平均不超過3年。故探尋腫瘤骨轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)記物，對骨轉(zhuǎn)移進(jìn)行早期診斷、早期治療是目前研究的方向。PSA已被廣泛應(yīng)用于PCa的早期篩查[1]，每年普查1次血清PSA和直腸指檢，使PCa患者的轉(zhuǎn)移率下降了75%，同時也提高了隱匿性PCa的發(fā)現(xiàn)率[2]，盡管這種簡便的PCa篩查方法有其不可替代的優(yōu)越性，也存在很多不足，需要辨證考慮其臨床實際意義。臨床上若能結(jié)合其他標(biāo)志物檢測，對PCa診療更具有指導(dǎo)意義。目前，國內(nèi)外研究較多的其他標(biāo)志物中，BSP最可能成為一種骨轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。

BSP是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種酸性糖蛋白，主要由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞合成，其分布相對局限，主要在礦化組織特異性表達(dá)[3]，在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞、血小板和多種骨轉(zhuǎn)移瘤中也能檢測到BSP的表達(dá)。正常人群血清BSP濃度為2～24 ng/ml[4]。BSP是通過與整合素家族中受體識別，介導(dǎo)細(xì)胞粘附和細(xì)胞遷移作用[5-6]。整合素是BSP的主要受體，是一類細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體家族分子。BSP也是一種重要的細(xì)胞因子，在介導(dǎo)細(xì)胞擴(kuò)散、移動，與基質(zhì)間的粘附、骨組織礦化與重建、免疫調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮重要作用[7-8]。

自1994年Bellahcène等[9]首次闡述了BSP在人乳腺癌轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)以來，許多臨床及試驗研究均證實，BSP與腫瘤的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]，其在乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤等腫瘤組織中高表達(dá)，而且在乳腺癌或PCa的骨轉(zhuǎn)移腫瘤中BSP表達(dá)顯著高于其他內(nèi)臟轉(zhuǎn)移腫瘤[11]。BSP在骨轉(zhuǎn)移中起著重要作用，其可調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞粘附能力，激活破骨細(xì)胞功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向骨組織侵襲、遷移、粘附和增殖。血清BSP含量可反映破骨細(xì)胞活性和骨吸收過程。國內(nèi)何建軍等[12]研究發(fā)現(xiàn)PCa骨轉(zhuǎn)移患者外周血清中BSP含量明顯高于無骨轉(zhuǎn)移者，通過測定血清BSP含量用來診斷骨轉(zhuǎn)移的特異度和靈敏度分為72.8%和71.12%；鄧立春等[13]也報道BSP診斷骨轉(zhuǎn)移的特異性和敏感度分別為71.4%和84.20%。國外Jain等[14]研究102例PCa患者在晚期階段血清BSP濃度顯著增高。因此，BSP被認(rèn)為是一種可用于評價骨轉(zhuǎn)移的早期、獨立的標(biāo)志物，而且，在眾多的骨轉(zhuǎn)移標(biāo)志物中，BSP是最有希望成為靶向治療的骨轉(zhuǎn)移標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)PCa高表達(dá)BSP，其陽性率為76.47%，且BSP表達(dá)與PCa病理分期、術(shù)前tPSA、周圍淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，而與患者年齡、病理類型均無相關(guān)。BSP表達(dá)陽性PCa患者，術(shù)后骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著增高，這與國內(nèi)外研究結(jié)果一致。

綜上所述，BSP在PCa中高表達(dá)，其在PCa的發(fā)生、發(fā)展、臨床進(jìn)展和浸潤轉(zhuǎn)移的病理過程中起著重要作用，尤其與骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有助于PCa的診斷、惡性程度的評估，并能為臨床醫(yī)生判斷患者預(yù)后提供重要的線索，可作為預(yù)測PCa骨轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，但其價值尚待擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更進(jìn)一步的探索。

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Association between the BSP expression and bone metastasis in prostate cancer tissue.

YU Shu-yong1,ZHU Qi-cong1,MAO Gao-cai2,LV Yang3,WANG Ya-hui1,YANG Lin1.Department of Oncology1,Department of Pathology2, Department of Clinical Laboratory3,the 187thHospital of Chinese PLA,Haikou 571159,Hainan,CHINA

ObjectiveTo explore the association between the expression of bone sialoprotein(BSP)and bone metastasis in prostate cancer tissue.MethodsSixty-eight patients with prostate cancer(PCa)between January 1,2006 and June 30,2013 in our hospital were selected as the experimental group,and 22 cases of patients with benign prostatic hyperplasia(BPH)as the control group.Immunohistochemical SP method was used to detect the BSP expression of PCa or BPH tissues.Analysis was conducted by combining information of pathological behavior and clinical follow-up survey.ResultsThe expressing rate of BSP in prostate cancer tissues(76.47%)was higher than that in BPH tissues(13.64%),and the difference was statistically significant(P＜0.001).The BSP expression in prostate cancer tissues was closely related to the tumor pathological stage(χ2=9.338,P=0.009),distant metastasis(χ2=6.38, P=0.012),while no association was found between BSP expression and age(χ2=0.593,μ=0.441),pathological grade(χ2= 0.057,P=0.972)and lymph node metastasis(χ2=0.126,P=0.722).Before surgery,the serum tPSA concentration of 52 BSP positive cases was higher than that of 16 BSP negative cases,and the difference was statistically significant [(69.06±25.52)μg/L vs(38.00±21.64)μg/L,F=19.355,P＜0.001].The bone metastases rate of BSP positive was significantly higher than that of BSP negative[(71.15%,37/52)vs(25.0%,4/16),(χ2=10.887,P=0.001)].ConclusionThe expression of BSP is closely related to bone metastasis in prostatic cancer.It might be a potential indicator for the prediction of bone metastasis in prostate cancer.

Prostate cancer;Bone sialoprotein(BSP);Bone metastasis;Immunohistochemistry

R737.25

A

1003—6350（2014）23—3461—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.23.1353

2014-05-15)

海南省衛(wèi)生基金資助項目（編號：瓊衛(wèi)2011-98號）

朱其聰。E-mail：zhuqicong1234@163.com