丙型肝炎病毒對白細胞介素32表達影響的研究

祝成亮，李 艷，劉興暉，葉芳麗

(1.武漢大學人民醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430060；2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院檢驗科，上海 200135；3.湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院檢驗科，湖北 十堰 442008)

丙型肝炎病毒對白細胞介素32表達影響的研究

祝成亮1，李 艷1，劉興暉2，3，葉芳麗1

(1.武漢大學人民醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430060；2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院檢驗科，上海 200135；3.湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院檢驗科，湖北 十堰 442008)

目的 探討丙型肝炎病毒(HCV)在體內(nèi)外對白細胞介素32(IL-32)表達的影響。方法 熒光定量PCR和免疫印跡法檢測Huh7.5.1細胞中IL-32 mRNA和蛋白的表達水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-32的血清含量。結(jié)果 HCV感染的Huh7.5.1細胞IL-32 mRNA和蛋白的表達水平較對照細胞高，HCV患者IL-32血清含量明顯高于健康對照(P＜0.05)。結(jié)論 HCV能夠在體內(nèi)外促進IL-32的合成和分泌。

丙型肝炎病毒；白細胞介素32；酶聯(lián)免疫吸附試驗；表達

據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，目前全球有大約1.7億的人感染丙型肝炎病毒(HCV)，約有20%的HCV患者會在20年內(nèi)發(fā)展成為肝硬化，一旦肝硬化形成，發(fā)展成為肝癌的進程為每年1%～4%，HCV肝損傷并非由病毒本身直接導致，而是由于病毒與機體免疫系統(tǒng)相互作用過程中導致正常肝組織產(chǎn)生纖維樣變引起。白細胞介素32(IL-32)是一種重要的炎癥因子，參與機體的炎癥反應。本研究主要通過體內(nèi)外實驗探討HCV對IL-32表達的調(diào)節(jié)，為揭示HCV的致病機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集HCV感染的患者138例，其中男性75例，女性63例，平均年齡(45.3±13.4)歲，所有患者均排除其他肝病毒和細菌的感染。選取126例健康體檢者作為對照，其中男性67例，女性59例，平均年齡(42.7±12.5)歲。

1.2 材料 人肝癌細胞系Huh7.5.1及含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1細胞由本室保存[1]；IL-32 ELISA檢測試劑盒購自美國Rapidbio公司；IL-32多克隆抗體購自購自美國美國Abcam公司；TRIzol R試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購自美國Promega公司，熒光定量PCR采用美國LC480 PCR儀。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) Huh7.5.1細胞用含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃恒溫箱中進行培養(yǎng)。

1.3.2 熒光定量PCR檢測 TRIzol R試劑提取Huh7.5.1細胞的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用IL-32基因的檢測引物5'-GAGACAGTGGCGGCTTAT-3' (上游)，5'-TCCTCAACATCCGGGACA-3'(下游)進行熒光定量PCR擴增，以β-actin為內(nèi)參照。

1.3.3 Western blot檢測 裂解液裂解Huh7.5.1細胞，取30μg蛋白樣品加入上樣緩沖液后進行SDS-PAGE電泳分離,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素(NC)膜上，分別加入IL-32蛋白多克隆抗體和二抗，最后采用電化學發(fā)光(ECL)進行顯色。

1.3.4 EIISA的檢測 IL-32血清含量采用ELISA法進行檢測，方法參照試劑盒說明書。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，HCV感染組和對照組IL-32血清含量的比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HCV患者IL-32血清水平升高 我們收集了138例HCV患者和126例健康體檢者血清，采用ELISA檢測了IL-32的水平。結(jié)果顯示，HCV患者血清IL-32水平[(162.54±43.78)pg/ml]顯著的高于健康體檢者水平[(98.59±37.36)pg/ml，P＜0.05]。

2.2 HCV在細胞水平上調(diào)IL-32 mRNA和蛋白的表達 為探討HCV在細胞水平對IL-32表達的影響，我們采用熒光定量PCR和Western blot檢測了含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1及其對照細胞IL-32 mRNA和蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，感染了HCV的Huh 7.5.1細胞IL-32 mRNA和蛋白的表達明顯升高。見圖1和圖2。

圖1 熒光定量PCR檢測IL-32 mRNA的表達

圖2 Western blot檢測IL-32蛋白的表達

3 討論

丙型肝炎病毒(HCV)是一種屬于黃病毒科家族的帶有包膜的RNA病毒，它包含一條長為9 600個堿基的正義單鏈RNA基因組。HCV感染能夠引起機體的炎癥反應，導致急慢性肝炎，最終發(fā)展為原發(fā)性肝癌(HCC)，HCV感染是HCC發(fā)生的主要原因之一。

白細胞介素32(IL-32)是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞因子，參與機體的炎癥反應，其基因定位于16號染色體上，含有8個小外顯子，主要由免疫細胞表達，但在一些炎癥部位的組織中也有表達[2]。研究證實艾滋病患者和流感患者血清中IL-32的表達升高[3]，在乙型肝炎的研究中也發(fā)現(xiàn)，乙肝患者IL-32的血清水平也明顯升高[4]。

在本研究中，我們通過ELISA的方法檢測了HCV患者和健康對照者血清含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCV患者IL-32血清含量明顯高于健康對照，表明HCV能夠在體外上調(diào)IL-32的表達。目前一般認為HCV并非直接損傷肝細胞，而是由于機體炎癥反應所引起。HCV感染機體后導致一系列細胞因子表達的升高，包括白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素12(IL-12)、γ-干擾素(IFN-γ)等[4]。IL-32能夠誘導很多炎癥因子如白細胞介素1β(IL-1β)，IL-6，白細胞介素8(IL-8)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)等的表達，進而引起機體的炎癥反應[5]。因此，HCV可能通過上調(diào)IL-32的表達來參與肝炎的發(fā)生和發(fā)展。

由于HCV主要感染肝細胞，我們采用熒光定量PCR和Western blot檢測了HCV病毒感染的肝癌細胞Huh7.5.1及其對照細胞IL-32表達的差異，發(fā)現(xiàn)HCV能夠在體內(nèi)促進IL-32的表達。研究證實流感病毒和乙型肝炎病毒(HBV)通過激活CREB和NF-κ B通路誘導IL-32的轉(zhuǎn)錄[2，6]，但HCV通過何種信號通路調(diào)節(jié)IL-32的表達，是否也通過激活CREB和NF-κ B通路進行調(diào)節(jié)，尚待進一步研究。

[1]祝成亮,李 艷,葉芳麗,等.丙型肝炎病毒上調(diào)膠原三股螺旋重復蛋白1的表達[J].海南醫(yī)學,2013,24(17):2497-2498.

[2]Li W,Liu Y,Mukhtar MM,et al.Activation of interleukin-32 pro-inflammatory pathway in response to influenza A virus infection[J]. PLoS One,2008,3(4):e1985.

[3]Xu Q,Pan X,Shu X,et al.Increased interleukin-32 expression in chronic hepatitis B virus-infected liver[J].

[4]Jung MY,Son MH,Kim SH,et al.IL-32 gamma induces the maturation of dendritic cells with Th1-and Th17-polarizing ability through enhanced IL-12 and IL-6 production[J].J Immunol,2011, 186(12):6848-6859.

[5]Nold-Petry CA,Nold MF,Zepp JA,et al.IL-32-dependent effects of IL-1beta on endothelial cell functions[J].Proc Natl Acad Sci U SA,106(10):3883-3888.

[6]Pan X,Cao H,Lu J,et al.Interleukin-32 expression induced by hepatitis B virus protein X is mediated through activation of NF-κB [J].Mol Immunol,2011,48(12-13):1573-1577.

Study on the effect of Hepatitis C virus(HCV)on the expression of interleukin 32.

ZHU Cheng-liang1,LI Yan1, LIU Xing-hui2,3,Ye Fang-lil.1.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital,of Wuhan Universety,Wuhan 430060,Hubei,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,Shanghai Pudong New Area Gongli Hospital,Shanghai, 200135,CHINA;3.Department of Clinical Laboratory,Dongfeng Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine, Shiyan 442008,Hubei,CHINA

Objective To explore the effect of hepatitis C virus(HCV)on the expression of interleukin 32 (IL-32).Methods The mRNA and protein expression of IL-32 in Huh7.5.1 cells were measured by real-time PCR and western blot.Serum levels of IL-32 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results Expression of IL-32 mRNA and protein was higher in Huh7.5.1 cells infected by HCV than in the control cells.Serum IL-32 levels was significantly higher in HCV patients as compared with healthy controls(P＜0.05).Conclusion HCV can upregulate the synthesis and secretion of IL-32 both in vivo and in vitro.

Hepatitis C virus;Interleukin 32;Enzyme-linked immunosorbent assay;Expression

R512.6+3

A

1003—6350（2014）18—2708—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.18.1062

2014-03-31)

國家臨床重點?？茖ｍ椊?jīng)費(編號：2010305)；國家自然科學基金(編號：81101485)；湖北省教育廳科學技術(shù)研究項目(編號：D20122404)

李 艷。E-mail：yanlitf1120@163.com