高效液相色譜法測定注射用頭孢曲松鈉含量的不確定度評定

董超琪,袁華峰,屈 蓉

（江蘇省泰州市食品藥品檢驗所,江蘇 泰州 225300）

一切測量結(jié)果都不可避免地存在不確定度,《測量不確定度評定與表示》將“測量不確定度”定義為“表征合理地賦予被測量之值的分散性,與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)”[1]。不確定度越小,測量結(jié)果的質(zhì)量越高,使用價值越大。依法設(shè)置的各級（食品）藥品檢驗所對外出具的檢驗檢測數(shù)據(jù)是判定藥品質(zhì)量的重要依據(jù),特別是當這些數(shù)據(jù)處于標準規(guī)定的邊緣時,引入不確定度參數(shù)對于評估定量分析方法的可靠性和測量結(jié)果的準確性就顯得尤為重要。筆者根據(jù)標準中的有關(guān)規(guī)定[1],對采用高效液相色譜（HPLC）法測定注射用頭孢曲松鈉含量的測量不確定度進行了分析,以期找出影響不確定度的因素,并對其不確定度進行了測量和評估。

1 儀器與試藥

Waters2695-2996型高效液相色譜儀；梅特勒 AG135型電子天平（十萬分之一）。頭孢曲松對照品（中國藥品生物制品檢定所,含量為83.7%,批號為130480-200903）；注射用頭孢曲松鈉（上海新亞藥業(yè)有限公司,規(guī)格為每支1.0 g,批號為120923）；乙腈為色譜純,水為純化水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 溶液制備

精密稱取頭孢曲松對照品 20.37 mg和 20.22 mg,分別置100 mL容量瓶中,加流動相適量使溶解并定容至刻度,搖勻,即得對照品溶液A和B。精密稱取平均裝量項下注射用頭孢曲松鈉24.33 mg和 24.81 mg,分別置 100 mL 容量瓶中,加流動相適量使溶解并定容至刻度,搖勻,即得供試品溶液A和B。

2.1.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:島津 C18柱（150 mm ×4.6 mm,5 μm）；流動相:0.02mol/L 正辛胺溶液-乙腈（73∶27）；檢測波長:254 nm；柱溫:30℃；流速:1.0mL/min。理論板數(shù)按頭孢曲松峰計算為5600。

2.1.3 測定方法

分別精密量取對照品溶液和供試品溶液各20μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,按外標法以峰面積計算含量。

2.2 不確定度評估

2.2.1 建立數(shù)學模型

根據(jù)測定過程,依據(jù)以下公式計算含量:

式中,Q為標示量的百分含量（%）,A樣為樣品溶液峰面積,A對為對照品溶液峰面積,V樣為樣品稀釋倍數(shù),V對為對照品稀釋倍數(shù),為平均裝量,W樣為樣品稱取量,W對為對照品稱取量,W標為標示量,S對為對照品純度。

2.2.2 不確定度來源

根據(jù)含量計算公式,分析每一測定步驟的影響因素,繪制因果關(guān)系圖,見圖1。

2.2.3 分析并計算不確定度分量

1）對照品純度的相對不確定度 urel（S對）

屬B類不確定度。頭孢曲松對照品純度為83.7%,使用說明未給出不確定度,假定[2]分布區(qū)間為±0.05%,按矩形分布換算:

2）對照品稱量的相對不確定度urel（W對）

來源主要有以下2處,均屬B類不確定度。

天平檢定的不確定度:潛在有“靈敏度”和“示值誤差”2個主要分量,由于減重稱量是在同一臺天平且很窄的范圍內(nèi)進行,靈敏度帶來的不確定度可以忽略不計（即天平量程范圍內(nèi)的系數(shù)漂移將被抵消）。天平檢定證書給出的最大允差為±0.05 mg,在95%置信概率時按正態(tài)分布分別評定其相對不確定度,0.05/1.96/20.37 = 1.25 × 10-3；0.05/1.96/20.22 = 1.26 × 10-3。

稱量的重復性:檢定證書給出的天平重復性誤差為±0.02mg,在95%置信概率時按正態(tài)分布分別評定其相對不確定度,0.02/1.96/20.37 = 5.01 × 10-4；0.02/1.96/20.22 = 5.05 × 10-4。

減重稱量是由相對獨立的2次稱量所得,每次稱量都會受到天平檢定和隨機變化（重復性）帶來的不確定度影響,因此:

圖1 因果關(guān)系圖

3）對照品溶液稀釋的相對不確定度 urel（V對）

玻璃量器體積檢定:屬B類不確定度。由《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG196-2006）查得,A級100 mL容量瓶的允差為±0.10 mL,按三角分布[3],相對不確定度為 0.10//100 =4.08 × 10-4。

溫度:屬B類不確定度,由量瓶體積校準時與試驗溫度不一致引入的不確定度。量瓶的體積是在20℃下進行校準的,試驗溫度在±3℃范圍內(nèi)變動,由于溶液的體積膨脹系數(shù)明顯大于量瓶容積的膨脹,故可只考慮前者的影響。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4,按矩形分布,則相對不確定度為 100×2.1×10-4×3//100 = 3.60 × 10-4。

由于采取2份對照品平行試驗,則

4）對照品溶液色譜峰面積的相對不確定度 urel（A對）

主要由峰面積重復性與儀器環(huán)境、進樣體積等其他因素的不確定度共同引起。峰面積重復性屬A類不確定度,可通過重復進樣測定而得；儀器環(huán)境、進樣體積等其他因素引起的不確定度屬B

6）樣品溶液稀釋的相對不確定度 urel（V樣）

玻璃量器體積檢定:參照3）對照品溶液項下方法分析,A級100 mL容量瓶的允差為±0.10 mL,按三角分布[3],則相對不確定度為 0.10//100=4.08 ×10-4。

溫度:分析參照3）對照品溶液項下方法分析項,按矩形分布,則相對不確定度為 100×2.1×10-4×3//100=3.60 × 10-4。

由于采取2份樣品平行試驗,則

類不確定度,由于對照品和供試品采用相同的進樣體積,且峰面積是在相同條件下測得,故此項可以忽略不計。取對照品溶液A重復測量3次,得到峰面積 S值為21478,平均峰面積為12585311,則 urel（A對1） =21478//12585311 =9.85 ×10-4；取對照品溶液A重復測量3次,得到峰面積 S值為51216,平均峰面積為 12368120,則 urel（A對2）=51216//12368120 =2.39 ×10-3。因此,

5）樣品稱量的相對不確定度 urel（W樣）

天平檢定的不確定度:參照2）對照品稱量項下方法分析,平均裝量及 2份樣品的相對不確定度分量依次為,0.05/1.96/1102.5 = 2.31 × 10-5；0.05/1.96/24.33 = 1.05 × 10-3；0.05/1.96/24.81 = 1.03 × 10-3。

稱量的重復性:參照2）對照品稱量項下方法分析,平均裝量及 2 份樣品的相對不確定度分量依次為,0.02/1.96/1102.5 =9.26 × 10-6； 0.02/1.96/24.33 = 4.19 × 10-4； 0.02/1.96/24.81 =4.11 ×10-4。因此,

7）供試品溶液色譜峰面積的相對不確定度 urel（A樣）

供試品溶液的色譜峰面積采用雙樣兩平行進行測定,測量次數(shù)較少,不確定度用極差法 μ=R/（C×S）計算,記錄雙樣測量峰面積為 15626976,15672378,15596231,15510234,因此:

S1=（15626976＋15672378）/2=15649677,R1=45402

S2=（15596231＋15510234）/2=15553232,R2=85997

取 n=2時,極差系數(shù) C=1.13,則相對不確定度:

2.2.4 相對不確定度分量匯總

通過以上量化分析,結(jié)果見表1。

2.2.5 合成不確定度 uc（Q）

表1 數(shù)據(jù)和相對不確定度

2.2.6 擴展不確定度 U

假定檢驗結(jié)果符合正態(tài)分布,在95%置信概率時,選擇包含因子 k=2,則 U = k× uc（Q）=2×0.65% =1.3%。

2.2.7 測量不確定度報告

本試驗注射用頭孢曲松鈉的含量為（94.7 ±1.3）%,k=2。

3 討論

測量不確定度評定步驟分為:建立數(shù)學模型；找出所有影響測量不確定度的影響量；分析并計算各影響量的標準不確定度分量；列出不確定度分量匯總表；將各標準不確定度合成得到合成

標準不確定度；計算擴展不確定度；給出測量不確定度報告。

從上述對注射用頭孢曲松鈉含量測定不確定度的分析可以看出,供試品溶液色譜峰面積引起的不確定度分量對含量測定的影響最大,因此應定期對實驗儀器進行檢定和維護,保持穩(wěn)定的狀態(tài),加強試驗過程的控制及標準操作規(guī)程訓練,以減少隨機變化和人為因素對試驗結(jié)果的影響。通過含量測定不確定度的影響因素分析,對于降低不確定度、提高檢測結(jié)果的準確性具有一定的指導意義。

參考文獻:

[1]JJF1059-1999,測量不確定度評定與表示[S].

[2]姜連閣,劉永成.白政忠.HPLC法含量測定不確定度分析及實例[J].藥物分析雜志,2007,27（11）:1804.

[3]中國實驗室國家認可委員會.化學分析中不確定度的評估指南[M].北京:中國計量出版社,2002:26.