一種改良型小鼠全腦缺血再灌注模型的制作

【摘 要】采取三血管阻斷法（3-VO法），建立C57BL/6小鼠全腦缺血再灌注模型，從形態(tài)學組織切片上觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變化，用于進一步研究腦缺血疾病的發(fā)生機制及臨床防治。經(jīng)統(tǒng)計學分析，3-VO法能引起實驗動物海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化，減少正常神經(jīng)元的數(shù)量，且頸總動脈結扎的時長為決定動物死亡率和神經(jīng)元損傷的重要因素，證實3-VO法能誘導實驗動物海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的病理學改變，為相關腦血管病的深入研究提供操作簡便的動物模型制作途徑。

【關鍵詞】全腦缺血再灌注 3-VO法 缺血性腦血管病

【中圖分類號】G642 【文獻標識碼】A 【文章編號】1674-4810（2014）21-0095-02

缺血性腦血管病是僅次于缺血性心臟病的導致人類死亡的第二大疾病。因此，全腦缺血動物模型的制作在缺血性腦血管病的研究領域成為近年研究的熱點。該動物模型的特點是可模擬腦血流中斷的狀態(tài)，引起主要集中于海馬CA1區(qū)、小腦的遲發(fā)性、選擇性神經(jīng)元損傷，尤其在海馬易損性等方面的應用較為廣泛。桂林醫(yī)學院用C57BL/6小鼠三血管阻斷法（3 vessel occlusion，3-VO法），即結扎延髓腹側面的基底動脈后短暫性阻斷雙側頸總動脈，從形態(tài)學組織切片上觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變化，為進一步研究全腦缺血再灌注損傷提供依據(jù)和手段。

一 材料與方法

1.實驗動物及其分組與模型制作

取26～35g雄性C57BL/6小鼠40只，隨機分為假手術組以及Ⅰ～Ⅲ組。4%水合氯醛對實驗動物進行麻醉，給藥容積為10ml/kg。實施麻醉后，將動物仰臥位固定，頸正中切口，剪去枕骨腹側面部分顱骨，用5-0縫線（上海浦東區(qū)金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司生產(chǎn)）結扎延髓腹側面上的基底動脈。分離雙側頸總動脈，穿線備用。依次縫合肌肉及皮膚，將動物放置于38℃恒溫加熱板保持2小時，以維持正常體溫。24小時后，拆線打開原手術傷口，同時結扎雙側頸總動脈。Ⅰ～Ⅲ組分別于結扎后10、12、14分鐘后，小心取下結扎于雙側頸總動脈的縫線，恢復灌注。假手術組動物進行以上除結扎基底動脈以及雙側頸總動脈之外的步驟。

2.腦組織標本的取材、染色和觀察

手術7天后，將各動物以4%水合氯醛10ml/kg腹腔注射麻醉，暴露心臟，先用生理鹽水灌注30分鐘，待肝臟變白后，換成4%多聚甲醛灌流，直至動物肝臟變硬，尾巴僵硬后，剪下頭部并開顱取腦，再浸入4%多聚甲醛中1天。取出固定好的腦組織，經(jīng)沖洗、脫水、透明、包埋等步驟后，制成4μm厚連續(xù)切片，每隔10張切片取連續(xù)2張進行尼氏染色，于高倍鏡下觀察拍照并對尼氏染色陽性神經(jīng)元進行計數(shù)。

3.數(shù)據(jù)分析與處理

如無特殊說明，實驗結果均用均數(shù)±標準差表示。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，各組尼氏染色陽性神經(jīng)元數(shù)用Wilcoxon Mann-Whitney秩和檢驗進行組間統(tǒng)計，并用Bonferroni法進行兩兩比較。

二 實驗結果

1.死亡率

基底動脈結扎后的死亡率為85%。死亡原因考慮為：（1）麻醉后的自主呼吸喪失；（2）不可避免的技術性失敗，導致基底動脈破裂或致死性出血。

雙側頸總動脈結扎后的動物死亡無技術性死亡，均為缺血引起。第Ⅰ組無動物死亡，然而隨著缺血時間的延長，死亡率升高，如第Ⅱ組的死亡率上升到了27%，第Ⅲ組的死亡率達36%。死亡的時間多集中在全腦缺血后的3～5天（65%）。

2.腦組織切片觀察

假手術組細胞3～4層，排列整齊緊密，細胞核大而圓、核仁清晰；尼氏小體染色濃密規(guī)則（圖A）。Ⅰ～Ⅲ組細胞排列散亂、部分丟失、胞核固縮，尼氏小體染色呈現(xiàn)不同程度的變淡或消散，且胞漿出現(xiàn)嗜酸性變化（圖B～D）。

全腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色情況（放大倍數(shù)200×）。（A）假手術組動物無CA1區(qū)海馬神經(jīng)元損傷。3-VO法全腦缺血10min（B）、12min（C）以及14min（D）后，可觀察到明顯的CA1區(qū)神經(jīng)元損傷。

每張尼氏染色切片高倍鏡下（200×）隨機選取大叔腦組織海馬雙側CA1區(qū)各5個不重疊的視野進行尼氏染色陽性神經(jīng)元計數(shù)：假手術組128±6，Ⅰ組53±3，Ⅱ組45±6，Ⅲ組32±5，Ⅰ～Ⅲ組與假手術組相比，P<0.05，提示實驗組動物神經(jīng)元變性具有統(tǒng)計學意義，即3-VO法具有全腦缺血引發(fā)神經(jīng)元變性的能力。

三 討論

我們采取3-VO法制作小鼠全腦缺血模型，主要是通過基底動脈和頸總動脈結扎，阻斷脊髓血流與腦血流之間的通路，從而引起短暫性的全腦缺血，引起海馬神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡。從實驗結果來看，病理性損傷的程度取決于頸總動脈的結扎時長，且結扎10分鐘是較為理想的缺血時間，因為能引起CA1區(qū)細胞50%左右的缺失，同時死亡率低。

但此種方法同樣存在個體差異大的問題，同時，術后存活率較低，被燒灼阻斷的椎動脈不可再通，改變了正常的解剖結構，影響再灌注的腦血流量，造成再灌注不完全。我們所采取的3-VO法操作簡便，因為在C57BL/6小鼠體內(nèi)，基底動脈位于枕骨大孔和第一頸椎之間，位置明顯，因而可提高實驗成功率，為相關腦血管病動物模型的制作提供更易于操作的方法和思路。

針對建立全腦缺血再灌注模型的實驗方法有很多種。Eklof等在1972年就提出了雙側頸總動脈結扎的全腦缺血再灌注模型，然而這種方法個體差異大，造成的病理損傷不穩(wěn)定。當前更流行的是四血管阻斷法（4-VO），即在電凝雙側椎動脈造成其永久性閉塞的情況下，結扎雙側頸總動脈，松開結扎線后可實施再灌注研究。

〔責任編輯：李錦雯〕