豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）：發(fā)病機(jī)理及與先天性免疫的相互作用（III，續(xù)完）

上期回顧：上期主要介紹豬圓環(huán)病毒臨床疾病（豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病、同事感染其他豬病病原）、治病機(jī)理（淋巴衰竭和免疫抑制）。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥；豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾??；致病機(jī)理；免疫相互作用；細(xì)胞因子

4 與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用

4.1 感染免疫細(xì)胞

體外培養(yǎng)的單核細(xì)胞、肺巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞可以攝取PCV2，并且在它們的細(xì)胞質(zhì)中可以檢測到PCV2特異性的抗原，雖然現(xiàn)在缺乏PCV2在單核細(xì)胞中復(fù)制的有力證據(jù)[91-93]。這說明這些免疫細(xì)胞可能不是PCV2復(fù)制的主要位置。還有證據(jù)表明，PCV2可在T和B淋巴細(xì)胞、來源于PBMCs的單核細(xì)胞和感染豬的氣管扁桃體中復(fù)制[89，90]。PCV2復(fù)制水平證明，來自氣管淋巴結(jié)的B淋巴細(xì)胞比來自PBMCs的更高[89，90]，說明B細(xì)胞可能是PCV2復(fù)制的靶位點(diǎn)。PCV2的內(nèi)化作用已在經(jīng)典的血液DC細(xì)胞和漿細(xì)胞樹突狀細(xì)胞上證實(shí) [94]，DC細(xì)胞內(nèi)PCV2的持續(xù)存在并不會降低病毒的感染力、導(dǎo)致細(xì)胞死亡或改變DC細(xì)胞的免疫功能[95]。PCV2可簡單地通過DC細(xì)胞對它們的吞噬和內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，而不是通過感染[95-97]（圖3）。不過，PCV2在DC細(xì)胞內(nèi)安靜地不復(fù)制的感染，可能有利于病毒逃避宿主的免疫系統(tǒng)和促進(jìn)PCV2利用DC細(xì)胞遷移的特性在豬群中傳播[95]。

PCV2可削弱干擾素產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生IFN-α和TNF-α的能力，從而抑制骨髓DC細(xì)胞自分泌和旁分泌的成熟過程[11，94]。在患有PMWS的豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的MHC-II的高水平活化和早期表達(dá)，IL-2受體CD25的高水平表達(dá)[66]。此外，巨噬細(xì)胞內(nèi)的PCV2會降低這些細(xì)胞的吞噬和殺菌能力，從而有利于PCV2的生存和傳播[91，92]。有報(bào)道稱，肺泡巨噬細(xì)胞感染PCV2后產(chǎn)生高水平的細(xì)胞因子，包括TNF-α、粒細(xì)胞集落刺激因子、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和IL-8[91，92]。免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞）的功能改變會削弱肺臟局部防御機(jī)制，導(dǎo)致肺部組織損傷[91，92]。PCV2介導(dǎo)對自然干擾素產(chǎn)生細(xì)胞的抑制可能具有廣譜作用，且可影響由Toll樣受體（如TLR7和TLR9激活劑）和其它豬病毒病原誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答效應(yīng)[98]，說明了PCV2對豬先天性免疫系統(tǒng)反應(yīng)的調(diào)節(jié)可能會使豬對繼發(fā)或協(xié)同感染的病毒和細(xì)菌更加易感[98]（圖3）。PCV2與免疫細(xì)胞及淋巴系統(tǒng)的相互作用可能在PCV2的發(fā)病過程中起到重要的作用[11]；因此，深入了解PCV2與免疫細(xì)胞的相互作用，對將來設(shè)計(jì)有效的豬群管理辦法和疾病控制策略具有重要的意義。

4.2 IL-10和其他細(xì)胞因子在PCV2致病過程中的作用

作為一種靶向作用于淋巴組織和免疫細(xì)胞的病毒—PCV2，它的感染可以顯著地改變感染豬體內(nèi)細(xì)胞因子的反應(yīng)。感染PCV2引起PCVAD的豬體內(nèi)IL-10和促炎性細(xì)胞因子，如IL-1和TNF-α表達(dá)水平上調(diào)，而IL-2和IL-4表達(dá)水平下調(diào)[11，18]。胸腺中IL-10基因表達(dá)上調(diào)與感染豬的胸腺衰竭和萎縮有關(guān)[99]?；糚CVAD的豬胸腺中的IL-10基因以及扁桃體內(nèi)IFN-γ基因的表達(dá)水平上調(diào)，脾臟中的IL-2和IL-12p40基因表達(dá)下調(diào)，扁桃體內(nèi)IL-4基因表達(dá)下調(diào)，腹股溝淋巴結(jié)IFN-γ基因、IL-10基因、IL-12p40基因和IL-4基因的表達(dá)下調(diào)[100]。豬亞臨床感染PCV2在病理變化高峰期也會短暫出現(xiàn)IL-10水平上升[101]。與PCV2陰性豬相比，感染PCV2的豬，體內(nèi)CD8+和CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，進(jìn)一步證實(shí)了PCV2感染會削弱宿主免疫反應(yīng)[65]。

PCV2感染誘導(dǎo)豬體內(nèi)MCP-1和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1（MIP-1）[102]的表達(dá)，說明MCP-1和MIP-1在淋巴結(jié)肉芽腫性炎癥反應(yīng)中有潛在的作用。此外，PCV-2感染后發(fā)展為嚴(yán)重的PCVAD的豬，在其體內(nèi)可以檢測到血清C-反應(yīng)蛋白和IL-10[103]，進(jìn)一步證實(shí)了促炎性細(xì)胞因子在PCV2發(fā)病機(jī)制中的作用。在感染PCV2的豬肺泡巨噬細(xì)胞中，TNF-α、IL-8、肺泡巨噬細(xì)胞來源的中性粒細(xì)胞趨化因子-II（AMCF-II）、G-CSF和MCP-1的基因表達(dá)顯著上升[91]。在患有PCVAD的豬中，體內(nèi)PBMCs通過釋放IL-10和IFN-γ可以對PCV2抗原產(chǎn)生良好的反應(yīng)，但是對絲裂原或超抗原只能產(chǎn)生很小的或沒有反應(yīng)，只能產(chǎn)生少量的IL-4、IL-2或IFN-γ[99]。此外PCV2還可以下調(diào)或抑制IL-4和IL-2從PBMC的釋放，刺激促炎性細(xì)胞因子，如IL-1β和IL-8的釋放[99]，這說明了患有PCVAD的豬抗病毒感染的免疫功能受到減弱。

總體來說，IL-10和其它促炎性細(xì)胞因子在PCV2致病和PCVAD發(fā)生上發(fā)揮著重要的作用[11，18]。免疫細(xì)胞損傷和細(xì)胞因子失衡與PCV2感染引起的多系統(tǒng)疾病有關(guān)（圖3）。因此，了解細(xì)胞因子失去平衡的潛在機(jī)制，可能有助于設(shè)計(jì)出更好的防控策略，以通過增強(qiáng)宿主免疫系統(tǒng)來抵抗PCV2感染和PCVAD。

4.3 病毒與宿主蛋白之間的相互作用

PCV2可能通過衣殼蛋白與病毒依賴受體，如多種細(xì)胞內(nèi)的粘多糖肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸軟骨素[20，104]相互作用，因此對豬的多種組織和器官具有廣泛的親嗜性[97]。PCV2衣殼蛋白通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，結(jié)合并進(jìn)入豬單核細(xì)胞3D4/31[105]，病毒的入侵似乎不依賴于發(fā)動蛋白和膽固醇，但是依賴于肌動蛋白和小GTP酶通路[106]。感染PCV2的豬腎細(xì)胞和感染PCV2的豬組織中與RNA剪切因子SPF30同源的細(xì)胞基因和透明質(zhì)烷介導(dǎo)的移動受體上調(diào)（107）。在感染PCV2的豬淋巴結(jié)組織中，參與先天性免疫防御的細(xì)胞基因（TLR1、CD14、CD80），免疫抑制基因（FGL2、GPNMB），促炎性信號基因（半乳凝素-3）和高速加工基因（ANGPTL-4）的表達(dá)水平發(fā)生改變，說明PCV2在免疫抑制、炎性細(xì)胞浸潤和體重減輕方面具有作用[108]。多種細(xì)胞蛋白，包括互補(bǔ)因子C1qB、E3泛素連接酶家族成員MKRN1和促凋亡基因產(chǎn)物Par-4，可以與PCV2衣殼蛋白和Rep蛋白相互作用[109，110]（表1），不過病毒與這些細(xì)胞蛋白相互作用的生物學(xué)意義還不清楚。

PCV2的ORF3與PCV1的相比是截短的。在體外條件下，當(dāng)哺乳動物細(xì)胞人為過表達(dá)PCV2的ORF3蛋白，ORF3蛋白會與pPirh2相互作用，并且與P53競爭結(jié)合Pirh2，消除p53自身穩(wěn)定性，導(dǎo)致p53水平上升，誘導(dǎo)感染細(xì)胞凋亡。雖然PCV2能否在豬體內(nèi)誘導(dǎo)感染細(xì)胞凋亡還充滿爭議[2，4]，PCV2的ORF3蛋白可能通過激活caspase-8和caspase-3通路誘導(dǎo)感染細(xì)胞凋亡[67]。PCV2的ORF3蛋白與G蛋白信使（RGS）調(diào)節(jié)因子結(jié)合，與LPS激活的豬PBMC的poRGS16共定位（表1）。PoRGS16可能參與了將ORF3蛋白轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核[110，111]。PCV2復(fù)制時(shí)激活NF-κB，細(xì)胞用NF-κB抑制劑處理可以減少病毒的復(fù)制[112]，說明了NF-κB的活化在協(xié)同多種控制免疫反應(yīng)的細(xì)胞基因表達(dá)上發(fā)揮重要的作用，從而促進(jìn)病毒的復(fù)制?，F(xiàn)在還不清楚病毒和細(xì)胞蛋白相互作用的細(xì)節(jié)，在這方面還存在許多未知的因素。小ORF3在病毒復(fù)制和致病機(jī)理上的表觀多功能性還有待驗(yàn)證。目前我們甚至還不知道ORF3蛋白是否能在感染PCV2的豬體內(nèi)產(chǎn)生。很明顯還需要在更多相關(guān)模型系統(tǒng)中探索病毒-宿主蛋白間的相互作用。

4.4 病毒DNA與宿主蛋白相互作用

PCV2的基因組DNA包含免疫調(diào)節(jié)序列，在PCV2 DNA方面，至少鑒定了五個(gè)含CpG基序的脫氧核糖核苷酸（ODNs）：其中四個(gè)ODNs刺激IFN-α的產(chǎn)生，還有一個(gè)具有IFN-α抑制活性[113]。PCV2 DNA的免疫調(diào)節(jié)序列基序可以通過與TLR9相互作用激活先天性免疫，導(dǎo)致IFN和其它抗炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[9，114]。因此PCV2 DNA的免疫調(diào)節(jié)序列與宿主細(xì)胞相互作用可能是PCV2致病的潛在機(jī)制[113，114]。PCV2感染自然干擾素產(chǎn)生細(xì)胞后，抑制它們對ODNs和TLR7與TLR9激活劑的反應(yīng)[98]。在感染PCV2前或同時(shí)感染PCV2時(shí)，PK-15和3D4/31細(xì)胞經(jīng)IFN-α和IFN-γ處理，可增強(qiáng)PCV2的復(fù)制[115]。在PCV2基因組的Ori基因上發(fā)現(xiàn)了干擾素刺激反應(yīng)元件（ISRE）的序列。如果用完整病毒的成分，而不是分離的，PCV2的ISRE在體外會影響PCV2復(fù)制的干擾素介導(dǎo)增強(qiáng)效應(yīng)[117]，以及在感染PCV2豬的病毒致病機(jī)理中發(fā)揮重要作用[118]。能夠與PCV2基因組中ISRE結(jié)合的細(xì)胞蛋白包括干擾素調(diào)節(jié)因子-1（IRF-1a）和鋅指蛋白ZNF683[9]。了解病毒的序列及它們與宿主細(xì)胞的相互作用，可能有利于在將來疫苗研發(fā)具有低毒力的遺傳修飾疫苗病毒。

5 保護(hù)性免疫

5.1 疫苗和免疫

目前至少有四種商業(yè)化疫苗可以抵御PCV2的感染和PCVAD[14]。FosteraTM PCV （輝瑞動物保健公司），之前稱為 Suvaxyn?PCV2 One DoseTM （美國富道動物保健公司）是第一個(gè)美國農(nóng)業(yè)部完全認(rèn)證的疫苗，它基于滅活和致弱的嵌合病毒（非致病性PCV1表達(dá)PCV2a的免疫原性衣殼蛋白）[31，32]。3周齡或更大年齡的仔豬單次肌肉注射FosteraTM PCV疫苗，可預(yù)防PCV2病毒血癥的發(fā)生和感染。Circovac? vaccine （法國梅里亞公司）是基于PCV2a病毒的滅活疫苗。3周齡或更大的仔豬單次肌肉注射免疫Circovac? vaccine，小母豬和母豬則免疫兩次。Ingelvac CircoFLEX? vaccine（勃林格殷格翰動物保健公司），Circumvent? vaccine （英特威/默克公司）和Porcilis? PCV （先靈葆雅/默克公司）都是基于在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)PCV2a衣殼蛋白制備的重組亞單位疫苗[14]。這些商業(yè)化PCV2疫苗的有效性已經(jīng)在可控的實(shí)驗(yàn)性攻毒豬中進(jìn)行了大量的研究。因?yàn)镻CV2單獨(dú)感染豬不會發(fā)展為完整的臨床PCVAD，采用PCV2協(xié)同感染模型可盡可能模擬野外條件，研究疫苗的有效性。疫苗試驗(yàn)研究證實(shí)疫苗對PCV2感染和PCVAD具有極好的有效性[42，119-125]。采用該疫苗后，PCVAD引起的仔豬致死率顯著降低，并且該疫苗可以成功地減少PCV2在歐洲、加拿大和美國豬群的致死率。

雖然目前基于PCV2a的商業(yè)化疫苗是有效的，但是研發(fā)針對目前全球流行的PCV2b基因型的疫苗是有意義的。此外MLV可能會提供更好的免疫保護(hù)，因?yàn)镸LVs不僅能誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，還能誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)抵抗PCV2感染[14]。田間PCV2的廣泛感染證明研發(fā)一種可以區(qū)別疫苗免疫和自然感染的標(biāo)記疫苗具有充分的根據(jù)。PCV2基因組衣殼蛋白的C端可以承受至少27個(gè)氨基酸插入[34，35]，在C端表達(dá)短的免疫性抗原決定標(biāo)簽的PCV1-2a致弱嵌合疫苗可以在感染豬產(chǎn)生針對PCV2的特異性中和抗體以及抗附加表位抗體[34，35]，這說明了致弱的表位標(biāo)簽的PCV2或嵌合PCV1-2可以用作MLV的compliance標(biāo)記。雖然目前PCV2免疫程序產(chǎn)生的免疫失敗案例很少，未來的研究仍然需要評估現(xiàn)在疫苗誘導(dǎo)的群體免疫對進(jìn)化的PCV2、新出現(xiàn)的變異株或疫苗逃避突變株的有效性。

5.2 中和抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫保護(hù)的作用

中和抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是抗PCV2感染重要的免疫相關(guān)保護(hù)[18]。PCV2感染豬誘導(dǎo)的病毒特異性中和抗體在大約接種后21 d[34，35，43，126]產(chǎn)生。PCV2實(shí)驗(yàn)性感染的生豬，可以在PBMCs中檢測到針對PCV2特異性的中和抗體和IFN-γ基因表達(dá)，不過被動免疫的產(chǎn)生在感染豬中存在差異。中和抗體的缺失可能是PCV2感染增強(qiáng)的重要因素[127]。PCV2中和抗體的產(chǎn)生與防止體外病毒復(fù)制和體內(nèi)發(fā)展成為PCVAD具有相關(guān)性[128，129]。PCV2衣殼蛋白免疫表位的圖譜已被繪制[126，130，131]，第47～57個(gè)氨基酸殘基和第165～200個(gè)氨基酸殘基包含中和表位。針對第47～57位和第156～200位的氨基酸殘基的中和抗體能否保護(hù)PCV2感染還有待深入研究。并不是所有豬在接種減弱嵌合PCV1-2a病毒疫苗后都會產(chǎn)生高水平的體液免疫，不過即使有的豬僅產(chǎn)生的低水平體液免疫，感染野生型PCV2后也會產(chǎn)生保護(hù)性免疫[132]。分泌IFN-γ的細(xì)胞對PCV2的感染表現(xiàn)為特異的反應(yīng)，可能會促進(jìn)豬體內(nèi)病毒的清除[132]，CD4+和CD8+ T細(xì)胞衰竭會減弱病毒特異的IFN-γ反應(yīng)[133]。因此，IFN-γ也可能與免疫保護(hù)具有重要關(guān)系。

6 總結(jié)

總的來說，PCV2是養(yǎng)豬生產(chǎn)上重要的病原。該病毒靶向作用于豬的免疫系統(tǒng)，引起免疫衰竭，導(dǎo)致感染豬群的免疫抑制和多系統(tǒng)性疾病。同時(shí)感染其它豬病病原或?qū)ωi使用疫苗和佐劑進(jìn)行免疫刺激會加重PCVAD。PCV2內(nèi)化進(jìn)入免疫細(xì)胞有利于病毒在豬群的傳播，以及影響重要的免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和DCs細(xì)胞的功能。IL-10和促炎性細(xì)胞因子的上調(diào)可能在PCV2的致病機(jī)理上發(fā)揮重要的作用。病毒的DNA成分和蛋白會與多種細(xì)胞基因的相互作用，控制免疫反應(yīng)促進(jìn)病毒的復(fù)制。中和抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是重要的抗PCV2感染的免疫保護(hù)。雖然現(xiàn)在有一些針對PCV2有效的商業(yè)化疫苗，但是全世界養(yǎng)豬業(yè)不斷報(bào)道出現(xiàn)PCV2突變株。

雖然自1998年發(fā)現(xiàn)PCV2后針對PCV2的研究已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步，但是還有許多問題有待闡明。還未發(fā)現(xiàn)對PCV2特異的細(xì)胞受體，PCV2生命周期的許多環(huán)節(jié)，包括脫殼、復(fù)制、組裝和釋放，還不是很清楚。作為感染哺乳動物的最小DNA病毒，PCV2復(fù)制非常依靠宿主細(xì)胞。因此了解病毒-宿主的相互作用是至關(guān)重要的，特別是在分子水平上與宿主免疫系統(tǒng)。鑒定參與到病毒-宿主相互作用的重要病毒和宿主因子以及闡明它們在病毒復(fù)制和致病的潛在作用也是重要的。雖然同時(shí)感染其它豬病病原和免疫刺激已經(jīng)被證實(shí)是加重PCVAD的輔助因子，其它會引起PCVAD發(fā)生的宿主和病毒因子還不清楚。病毒基因組中能增強(qiáng)毒力的遺傳元件可能還有待深入研究。ORF3在誘導(dǎo)受感染細(xì)胞凋亡和致病機(jī)理上還充滿爭議，且有待深入研究。PCV2已經(jīng)逐步具有復(fù)雜的機(jī)制逃避宿主的免疫反應(yīng)，引起細(xì)胞因子及其他免疫系統(tǒng)失去平衡，導(dǎo)致PCVAD的發(fā)生。因此，將來的研究還需要調(diào)查PCV2與免疫細(xì)胞（如漿細(xì)胞DCs）相互作用的機(jī)制。

PCV2的進(jìn)化速度比我們之前對DNA病毒預(yù)測的速度要快很多，PCV2遺傳變異株的出現(xiàn)及它們對現(xiàn)有疫苗有效性的影響還有待研究。雖然第一例臨床PCVAD病例在20世紀(jì)90年代晚期才發(fā)現(xiàn)，但該病毒在60年代就已經(jīng)開始傳播[134]；病毒為何在20世紀(jì)90年代后期突然致病還是個(gè)謎。在實(shí)驗(yàn)室條件下，PCV1可以感染人肝癌細(xì)胞[135]，人的糞便樣本中也能檢測到環(huán)狀病毒樣DNA的序列[136]，不過它們的生物學(xué)意義還不清楚。雖然PCV2經(jīng)動物感染人還缺乏確切證據(jù)，但是在人輪狀病毒減毒活疫苗中發(fā)現(xiàn)PCV污染引發(fā)了對疫苗安全性的憂慮。很明顯在未來需要鑒定決定物種和組織嗜性的細(xì)胞和病毒因子，以評估PCV2人畜共患性的能力?！酢?/p>

原題名：Porcine Circovirus Type 2 （PCV2）： Pathogenesis and Interaction with the Immune System（英文）

原作者：Xiang-Jin Meng（美國弗吉尼亞理工大學(xué)院獸醫(yī)學(xué)生物醫(yī)學(xué)和病理學(xué)系）