腸細(xì)胞對(duì)國(guó)際藥用輔料協(xié)會(huì)（IPEC）腸道健康研究的重要性

進(jìn)行腸上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)是研究小腸功能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收機(jī)制及其調(diào)控的主要手段之一。本文綜述了國(guó)外已經(jīng)建立的幾種特殊的腸上皮細(xì)胞系。

細(xì)胞培養(yǎng)物基本上分為兩種類(lèi)型：（a）原代細(xì)胞培養(yǎng)和（b）連續(xù)細(xì)胞系。原代細(xì)胞直接分離自一個(gè)有限壽命的物體，而連續(xù)細(xì)胞系，也稱(chēng)確立細(xì)胞系或無(wú)限增殖化細(xì)胞系，具有持久的增殖能力。

有幾種方法可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的無(wú)限增殖：腫瘤細(xì)胞和未分化的細(xì)胞具有天生的不死特性，而正常細(xì)胞可通過(guò)病毒添加外源基因?qū)崿F(xiàn)永生（賦予腫瘤細(xì)胞的能力）。

連續(xù)細(xì)胞系可以形成科學(xué)團(tuán)體指定的細(xì)胞系，并且是在最基礎(chǔ)水平上研究特定影響因子（如飼料添加劑、藥物、微生物）對(duì)特定類(lèi)型的細(xì)胞（上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞）作用的最常用且最有效的模型之一。

細(xì)胞可以用平板接種培養(yǎng)，并能在適當(dāng)?shù)臏囟取⒒旌蠚怏w和生長(zhǎng)媒介中維持生長(zhǎng)。

IPEC-J2是一個(gè)從新生仔豬上分離而來(lái)的未轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞系，新生仔豬目前仍被用作病原體，如沙門(mén)氏菌、大腸桿菌和其他菌毒，實(shí)驗(yàn)性攻毒的模型（圖1）。

本文我們將介紹使用IPEC-J2細(xì)胞系作為這些攻毒條件（感染）下飼料原料和飼料添加劑的研究模型。

1 IECs是什么

腸上皮表面面積約100 m2。它由一個(gè)可以將腸道內(nèi)腔與宿主組織的外部環(huán)境分隔開(kāi)來(lái)的單層柱狀上皮腸細(xì)胞（Epithelial Intestinal Cells，IECs）組成。

IEC參與了消化系統(tǒng)的多種功能，如養(yǎng)分的吸收、水、電解質(zhì)的交換和激素的產(chǎn)生。

由于其經(jīng)常暴露在外部環(huán)境中，IEC對(duì)維持腸上皮細(xì)胞的完整性、降低外來(lái)因子入侵風(fēng)險(xiǎn)，形成物理屏障至關(guān)重要。IEC對(duì)維持腸道生理的穩(wěn)定也是至關(guān)重要的。

由于上皮腸細(xì)胞具有能夠?qū)⒛c道與外部環(huán)境中的微生物分隔開(kāi)、進(jìn)而可阻止微生物侵入動(dòng)物組織中的兩種物理結(jié)構(gòu)（微絨毛緊密連接），它有助于機(jī)體建立物理屏障功能。IEC還會(huì)分泌各種抗菌的多肽、細(xì)胞因子和能夠在病理或感染狀態(tài)下被激活進(jìn)而能增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的趨化因子。

在感染期間中，當(dāng)病原體破壞腸粘膜時(shí)，它會(huì)被Toll樣受體（Toll-Like Receptors，TLR）所識(shí)別。TLR在腸表面表達(dá)，在先天性免疫中扮演著關(guān)鍵性的作用，因?yàn)樗鼈兡芗せ蠲庖呒?xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)。

IEC內(nèi)有能夠分析黏液的杯狀細(xì)胞。這種粘液含有能夠形成滲透屏障的粘蛋白，該屏障可保護(hù)并修復(fù)腸上皮細(xì)胞的任何損傷。粘蛋白還可以與細(xì)菌相互作用，并能夠通過(guò)腸道的蠕動(dòng)免疫并消除它們。

2 腸細(xì)胞系

很多研究以源自患癌變的人結(jié)腸（如HT-29，T84，Caco-2細(xì)胞株）或十二指腸（如HuTu-80）的腸上皮細(xì)胞為研究對(duì)象。另外，一些研究以尚未癌變的家鼠小腸細(xì)胞系（例如IEC-6和IEC-18）為對(duì)象。

然而，老鼠的胃腸道結(jié)構(gòu)和功能似乎與其他家養(yǎng)哺乳動(dòng)物，如豬不同。

如今，有三種不同的豬腸上皮細(xì)胞系：

●IPI-21細(xì)胞分離自成年公豬的回腸組織，并與能夠使該細(xì)胞發(fā)生無(wú)限增殖的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)化。

●IPEC-1細(xì)胞來(lái)自1日齡仔豬回腸和空腸組織的混合物。它是未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。

●IPEC-J2細(xì)胞系來(lái)自1日齡仔豬空腸組織，也未轉(zhuǎn)化。

缺乏來(lái)自非腫瘤的腸細(xì)胞系和對(duì)豬腸細(xì)胞系的特異性，表明了IPEC-J2細(xì)胞系的重要性，進(jìn)一步考慮后發(fā)現(xiàn)它可能相應(yīng)地說(shuō)明受到大量的微生物感染。最重要的是，因?yàn)檠芯勘砻?，用IPEC-J2未完成的研究結(jié)果可以被豬的全動(dòng)物研究所利用（圖2）。

3 IPEC會(huì)受到怎樣的影響

自2006年Shierack等完成特性鑒定后IPEC-J2越來(lái)越多地被利用。從那時(shí)起，不少于15篇文章介紹了各種細(xì)胞和免疫分子的表達(dá)，超過(guò)20余篇論文把它們當(dāng)作微生物感染的腸上皮模型。

在鑒定之前，IPEC-J2細(xì)胞被用作豬增生性腸?。ò麅?nèi)勞森氏菌）感染的模型，因?yàn)樵摬∧軌蜻m應(yīng)IPEC-J2細(xì)胞并利用它們進(jìn)行增生，在衣原體感染上也觀(guān)察到了這種情況。

在Shierack等（2006）鑒定IPEC-J2細(xì)胞時(shí)，證明IPEC還支持不同種類(lèi)的沙門(mén)氏菌入侵和大腸桿菌的粘附。

這些細(xì)菌能夠誘發(fā)炎癥和免疫應(yīng)答反應(yīng)（如細(xì)胞因子和Toll樣受體的表達(dá)）的能力，在以下利用IPEC-J2進(jìn)行的研究中被反復(fù)證明。研究還表明，IPEC-J2單分子層的滲透性（用反式上皮電阻測(cè)定，英文名：Trans-Epithelial Electrical Resistance，TEER）會(huì)因腸毒素大腸桿菌（Enterotoxic Escherichia Coli，ETEC）的感染而降低（圖3）。

大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和衣原體是養(yǎng)豬業(yè)中重要的病原體，也是采用調(diào)試截然不同感染策略的代表，這就是為何IPEC-J2細(xì)胞系是研究這些病原菌與豬腸上皮細(xì)胞相互作用的一個(gè)理想模型的最重要理由之一。

ETEC也通過(guò)IPEC-J2得到了徹底的研究，它們?cè)诩?xì)胞粘附上的作用由Johnson等（2009）闡明。粘附是關(guān)鍵的一步，因?yàn)镋TEC粘附在腸黏膜上是其定植先決條件。

IPEC-J2細(xì)胞已越來(lái)越多地被用于研究潛在的益生菌微生物，重點(diǎn)是益生菌對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的粘附性或益生菌阻止由特定病原體誘發(fā)的炎癥反應(yīng)的能力。

這些益生菌中的一部分例子有腸球菌株、釀酒菌株或多種乳桿菌。這些研究的有效性仍停留在研究層面，使用測(cè)試益生菌進(jìn)行的體內(nèi)研究結(jié)果仍未發(fā)表。

最近發(fā)表的論文中，多種飼料原料（麥麩、酪蛋白糖巨肽、甘露寡糖、刺槐豆提取物和米曲霉發(fā)酵提取物）能夠阻止ETEC與IPEC-J2的粘附，并能干擾先天性炎癥反應(yīng)。另一項(xiàng)研究表明，肌醇六磷酸可以減少?lài)I吐毒素對(duì)腸上皮細(xì)胞系的膜完整性的負(fù)面影響。在IPEC研究所用的各種飼料原料或添加劑中，我們將對(duì)那些與使用并影響腸上皮中鋅有關(guān)的飼料原料和添加劑給予特別的關(guān)注（圖4）。

4 鋅的添加量和來(lái)源

養(yǎng)豬行業(yè)廣泛地采用飼料中添加藥理水平的氧化鋅（ZnO，2 500 mg/kg ～3 000 mg/kg）來(lái)降低仔豬斷奶后的腹瀉發(fā)生率及其嚴(yán)重程度，特別降低由ETEC K88引發(fā)的腹瀉。

然而，其作用機(jī)理仍未能充分掌握。首個(gè)以人腸道細(xì)胞系Caco-2進(jìn)行的體外研究證明，提高氧化鋅的濃度能夠降低ETEC K88對(duì)該細(xì)胞系的粘附和轉(zhuǎn)化。還發(fā)現(xiàn)，氧化鋅可防止由ETEC誘發(fā)的緊密連接滲透性增強(qiáng)和ETEC誘導(dǎo)表達(dá)的多種炎癥反應(yīng)。

該項(xiàng)研究并沒(méi)有顯示氧化鋅的抗菌效果，并提出了飼喂氧化鋅的豬斷奶后腹瀉發(fā)病率下降的另一種機(jī)理。然而，如上所述，Caco-2細(xì)胞是一種人的腸道細(xì)胞系，而ETEC K88是一種豬源性病原體。最近的一些研究旨在探討氧化鋅添加量和來(lái)源對(duì)受到ETEC攻擊的IPEC-J2細(xì)胞的作用，研究更為理想的研究豬的模型。IPEC-J2細(xì)胞被用作在添加或不添加氧化鋅時(shí)腸道ETEC感染的體外模型。

基因組分析顯示了大量的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)基因的表達(dá)增加（如細(xì)胞因子基因），以應(yīng)對(duì)ETEC的感染，但當(dāng)細(xì)胞同時(shí)接觸氧化鋅時(shí)，先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)基因的表達(dá)下降。

代謝效應(yīng)表明，氧化鋅在低濃度時(shí)可使IPEC-J2細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，而在高濃度時(shí)能夠降低細(xì)胞的活力。當(dāng)ETEC粘附于宿主細(xì)胞僅2 h后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果添加氧化鋅沒(méi)有表現(xiàn)出任何效果（圖5）。

然而，當(dāng)經(jīng)過(guò)一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)期進(jìn)行測(cè)定時(shí)，氧化鋅以不會(huì)影響IPEC-J2形態(tài)的濃度添加時(shí)，會(huì)減弱ETEC粘附能力。這些結(jié)果表明，氧化鋅的劑量和來(lái)源會(huì)對(duì)IPEC-J2和病原體的代謝產(chǎn)生顯著的影響，當(dāng)IPEC-2受到病原體的攻擊時(shí)還會(huì)減弱炎癥基因的表達(dá)。

5 結(jié)論

腸上皮細(xì)胞是動(dòng)物抵抗外部環(huán)境病原體入侵的第一防線(xiàn)，對(duì)炎癥反應(yīng)也起到重要的作用。

將上皮細(xì)胞系用作體外模型在未來(lái)將越來(lái)越多。

IPEC-J2細(xì)胞系可提供一個(gè)能夠研究飼料原料對(duì)特定病原體所引發(fā)炎癥反應(yīng)影響的理想的特殊豬模型。

可以預(yù)測(cè)，今后IPEC-J2和其他細(xì)胞系的利用將增加。IPEC-J2可能是研究氧化鋅治療機(jī)理的一個(gè)理想模型?！酢?/p>

原題名：Importance of intestinal cells for gut health-IPEC studies（英文）

原作者：R. Davin（西班牙）