檳榔植原體膜蛋白基因的克隆及其抗血清制備

楊文君等

摘 要 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的檳榔植原體膜蛋白基因（AcPmp）序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物mp-FP/mp-RP，以病樣檳榔總DNA為模板擴(kuò)增該AcPmp的編碼區(qū)并連接到pMD19T simple中間載體。將測(cè)序正確的陽性菌提取質(zhì)粒pMD19T-AcPmp，經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收AcPmp片段，然后以正確的編碼框連接到原核表達(dá)載體pET32a（+），轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21感受態(tài)細(xì)胞。含有pET32a-AcPmp的BL21表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE分析表明，在30 ℃，0.1 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)4 h，可產(chǎn)生部分可溶性的融合蛋白。利用Ni2+-NTA親和層析柱法進(jìn)行純化并獲得高純度的可溶性融合蛋白。將純化后的融合蛋白多次免疫家兔，取其抗血清，以融合蛋白（1 ∶ 10 000稀釋）作抗原，間接ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià)大于125 000。Western Blot雜交結(jié)果表明檳榔植原體膜蛋白抗血清能與融合蛋白特異性結(jié)合。

關(guān)鍵詞 檳榔植原體；膜蛋白基因；原核表達(dá)；抗血清制備

中圖分類號(hào) S59 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Total DNA was extracted from the infected Areca and used for amplifying the membrane protein gene of Areca Phytoplasma by using primers mp-FP/mp-RP based on its sequence from previous study. The membrane protein gene was finally inserted into prokaryotic expression vector pET-32a（+）and the recombinant plasmid pET32a-AcPmp was identified by NcoⅠ/XhoⅠ restriction enzymes and Sanger sequencing. Subsequently the recombinant plasmid was transferred into Escherichia coli BL21 competent cell， and the positive colony was induced at 30 ℃ with 0.1 mmol/L IPTG for 4 hours. The result showed that small part of soluble fused protein was expressed and then purified by Ni2+-NTA agarose affinity chromatography， and the high purity of fused protein was finally obtained in 500 mmol/L imidazole Elution buffer. Two rabbits were immunizeed for 3 times by using purified protein and phosphate buffer control the antiserum against Phytoplasma MP was collected and indirect. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay（ID-ELISA）indicated that the titer of antiserum was higher than 1 ∶ 125 000. Western Blot analysis further showed that the antiserum was specifically binding with the MP fused protein.

Key words Areca phytoplasma； Membrane protein gene； Prokaryotic expression； Preparing anti-serum

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.024

檳榔（Areca catechu Linnaeus）屬棕櫚科檳榔屬（Areca）多年生常綠喬木，是一種典型的熱帶經(jīng)濟(jì)作物和觀賞作物，也是重要的南藥資源之一。據(jù)報(bào)道，在中國海南省，檳榔是第二大經(jīng)濟(jì)作物。而檳榔黃化病是檳榔上主要的病害之一，現(xiàn)已遍及印度、中國等大部分檳榔生產(chǎn)國主產(chǎn)區(qū)，造成檳榔大面積減產(chǎn)，并且有進(jìn)一步擴(kuò)大的趨勢(shì)。1976年后，國內(nèi)外科研工作者通過各種方法證實(shí)了在發(fā)病的檳榔中存在植原體[1-7]，但是植原體是否為檳榔黃化病的真正病原還在進(jìn)一步研究當(dāng)中。

植原體（Phyltoplasm）原稱類菌原體（mycoplasma like-organism，MLO），是一類無細(xì)胞壁的植物病原微生物，其基因組較小（約0.53～1.35 Mb）[8-9]，（G+C）含量較低（約25 mol），在系統(tǒng)分類學(xué)上植原體屬于柔膜體綱（Mollicutes）[10]。就物種起源而言，植原體被認(rèn)為是厭氧植原體屬中形成的一個(gè)單元演化分枝；從進(jìn)化學(xué)說而論，植原體來自于革蘭氏陽性菌，梭菌屬細(xì)菌的祖先[11]。植原體不能人工培養(yǎng)，主要寄生于植物韌皮部篩管細(xì)胞中，可引起植物植株黃化、叢枝、花變?nèi)~、矮縮或花器返祖等癥狀，給經(jīng)濟(jì)作物造成巨大的損失[12]。自1967年由Doi首次報(bào)道植原體以來，至今已發(fā)現(xiàn)有300多種植物的病害與植原體相關(guān)，其中在中國已報(bào)道的約74種[13-15]。由于植原體沒有細(xì)胞壁，菌體細(xì)胞膜直接與寄主植物或蟲媒介體細(xì)胞接觸，因此，認(rèn)為其膜蛋白可能在蟲媒介體-植原體-寄主植物的相互關(guān)系中起著非常重要的作用[16-21]。

本研究PCR擴(kuò)增獲得海南瓊海檳榔植原體膜蛋白基因（AcPmp）編碼區(qū)序列，構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET32a（+）并轉(zhuǎn)化表達(dá)菌。通過該融合蛋白的表達(dá)、Ni2+-NTA親和層析柱法純化以及家兔免疫，制備了效價(jià)高、特異性強(qiáng)的檳榔植原體膜蛋白抗血清，為后期著手開展植原體膜蛋白與寄主蛋白之間的互作等研究奠定了前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病樣 檳榔黃化病病樣材料采至海南瓊海，16S rRNA檢測(cè)為陽性。健康檳榔由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 克隆載體pMD19T simple vector購至大連寶生物公司（TaKaRa）；表達(dá)載體pET-32a（+）由本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆菌株E.coli DH5α購至北京全式金生物技術(shù)有限公司；表達(dá)菌株E.coli BL21（DE3）購至德國默克公司。

1.1.3 酶和化學(xué)試劑 PrimerSTARTM HS DNA polymerase、rTaq DNA polymerase、氨芐青霉素（Ampicillin）、IPTG均購自大連寶生物公司；限制性內(nèi)切酶NcoⅠ/XhoⅠ購自Fermentas公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA Marker購自天根生化科技有限公司；蛋白低分子量Marker購自Promega公司；丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）購自Solarbio公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）、考馬斯亮藍(lán)R-250購自Amresco公司；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 檳榔基因組總DNA提取按照本實(shí)驗(yàn)室改良的CTAB法[22]。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的克隆及測(cè)序 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的檳榔植原體膜蛋白基因編碼區(qū)序列（圖1）設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物mp-FP（5′-TGCCATGGCTATGAATCAC

AAAGAAAATTTTTTA-3′，含NcoⅠ酶切位點(diǎn)）和mp-RP（5′-CCCTCGAGTTATGATTGTACTTTTAAGT

CTGT-3′，含XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。引物由Invitrogen公司合成。

PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性3 min ；94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s ，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min并終止。取適量PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠（1%）電泳檢測(cè)，剩余PCR產(chǎn)物采用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生物技術(shù)有限公司）回收純化，具體操作過程參照說明書進(jìn)行。將純化PCR產(chǎn)物用T-A克隆的方法連接到質(zhì)粒pMD19T simple vector（TaKaRa公司），轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌。經(jīng)菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切（NcoⅠ/XhoⅠ）鑒定后，陽性克隆子送往上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 將中間質(zhì)粒pMD19T-AcPmp和表達(dá)載體pET32a（+）分別進(jìn)行NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切，37 ℃水浴過夜。TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化線性的AcPmp和pET32a（+）片段。將回收的目的基因AcPmp片段連接到pET32a（+）上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-AcPmp。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)菌液PCR和NcoⅠ/XhoⅠ質(zhì)粒雙酶切鑒定后，再隨機(jī)選擇3個(gè)陽性單克隆送往上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性分析 含有重組質(zhì)粒pET32a-AcPmp的大腸桿菌（BL 21）以1 ∶ 100的接種量接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100 μg/mL）中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)。A600值達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，30 ℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3～6 h。

取不同誘導(dǎo)時(shí)間的表達(dá)菌液1 mL加入2 mL離心管中，12 000 r/min離心1 min，棄上清，沉淀用50 μL雙蒸水懸浮，再加入50 μL的2×SDS-PAGE上樣緩沖液混勻，沸水浴煮5 min后放置在冰上2 min。在4 ℃條件下，12 000 r/min離心1 min，取上清10 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳。另收集經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h的菌液10 mL，離心沉淀后用500 μL雙蒸水懸浮細(xì)胞，使用超聲波進(jìn)行菌體破碎；離心后將上清轉(zhuǎn)到2 mL離心管中，沉淀用500 μL雙蒸水重懸。取5 μL上清和5 μL沉淀，加入等體積2×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴煮5 min。取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析融合蛋白的可溶性。

1.2.5 融合蛋白的純化 擴(kuò)大培養(yǎng)pET32a-AcPmp表達(dá)菌至1 L，按上述條件誘導(dǎo)表達(dá)4 h。于4 ℃ 6 000 r/min離心30 min，菌體沉淀溶于50 mL Binding buffer中，冰浴放置30 min。冰上超聲波破碎儀破碎細(xì)胞后，于4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，上清過0.45 μm濾膜。過膜上清液進(jìn)行Ni2+-NTA親和層析柱純化：用6 mL滅菌水洗滌瓊脂糖樹脂2次，再用6 mL Binding Buffer平衡親和柱；然后含目的蛋白的上清液上柱，用6 mL Washing Buffer（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）洗脫雜蛋白；最后再以6 mL Elution Buffer（500 mmol/L NaCl，0.5 mol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）將融合蛋白洗脫下來。融合蛋白溶液置換：將含有融合蛋白的Elution Buffer置于透析袋經(jīng)100 mL 1×PBS溶液透析3次，即可獲得溶于PBS的純化蛋白。

1.2.6 抗血清制備及血清學(xué)檢測(cè) 純化的融合蛋白溶液經(jīng)透析袋透析后獲得溶于1×PBS的蛋白溶液，利用BCA法測(cè)定其濃度后，與佐劑（1 ∶ 1）混勻，采用皮下多點(diǎn)注射抗原的方法多次免疫家兔，每只家兔的融合蛋白總注射量為1.5～2.0 mg。第3次免疫10 d后，每只白兔耳緣靜脈取血0.5～1.0 mL，分離抗血清。以1×PBS的蛋白溶液（1 ∶ 10 000）作抗原，ID-ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)，血清效價(jià)未符合要求則繼續(xù)免疫。血清效價(jià)符合要求后，心臟采血，分離抗血清。以免疫前的家兔血清為對(duì)照。

1.2.7 Western Blot鑒定抗血清特異性 取誘導(dǎo)表達(dá)4 h的pET32a-AcPmp菌體，處理后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。用蒸餾水漂洗電泳后的蛋白膠，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)液中平衡10 min。利用轉(zhuǎn)膜儀在100 V，60 mA的條件下反應(yīng)1 h使蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，取出NC膜并在蒸餾水中漂洗。將NC膜平衡于TBST緩沖液[20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），150 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20]后，置于含有5%脫脂牛奶的封閉液中封閉過夜（4 ℃）。然后用TBST緩沖液漂洗NC膜3次，將其放入按1 ∶ 5 000的一抗TBST溶液，在37 ℃孵育40 min。取出NC膜經(jīng)TBST漂洗后，轉(zhuǎn)入按1 ∶ 30 000稀釋的堿性磷酸標(biāo)記的山羊抗兔（IgG）TBST溶液中，37 ℃孵育40 min。再取出NC膜，經(jīng)TBST漂洗后，滴加含有330 μg/mL NBT（0.5 g NBT溶于10 mL 70%的二甲基甲酰胺）和165 μg/m LBCIP（0.5 g BCIP溶于10 mL 100%的二甲基甲酰胺）的顯色液于NC膜蛋白面，直到條帶清晰后，用蒸餾水漂洗2次，終止顯色反應(yīng)。取出NC膜晾干并掃描保存圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 AcPmp基因克隆和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

從病樣總DNA中擴(kuò)增獲得的AcPmp基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果如圖所示（圖2），擴(kuò)增片段大小約為500 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，而健康植株和ddH2O對(duì)照均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。

構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pET32a-AcPmp經(jīng)XhoⅠ/NcoⅠ雙酶切驗(yàn)證，出現(xiàn)特異性DNA條帶，其中一條大小約為500 bp（圖3），與預(yù)期AcPmp基因片段結(jié)果相符。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證明成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-AcPmp。

2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示（如圖4）：含有pET32a-AcPmp重組質(zhì)粒的表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4、6 h后，在大小約37 ku處均有一明顯的蛋白條帶，其大小與預(yù)估的融合蛋白（6×His-AcPmp）符合。而未誘導(dǎo)的BL21表達(dá)菌、pET32a/BL21表達(dá)菌、pET32a-AcPmp/BL21表達(dá)菌和IPTG誘導(dǎo)的BL21表達(dá)菌、pET32a/BL21表達(dá)菌均未出現(xiàn)該特異蛋白條帶。

融合蛋白的可溶性分析（如圖5）：SDS-PAGE膠顯示融合蛋白（6×His-AcPmp）主要以沉淀的形式表達(dá)，但是仍有一小部分溶于溶液中，即可溶性融合蛋白，含量較低。

2.3 融合蛋白的純化

為了簡(jiǎn)便操作過程和盡量保持融合蛋白的生物活性，筆者選擇上清液（可溶性的融合蛋白）進(jìn)行Ni2+-NTA親和層析蛋白純化。于30 ℃，IPTG終濃度為0.1 mmol/L的條件下，對(duì)重組表達(dá)菌pET32a-AcPmp/BL21進(jìn)行大量（1 L）誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。如2.2所述，獲得的融合蛋白大部分以包涵體形式存在，但也有一小部分可溶于溶液中，即是可溶性的?？扇苄缘碾s蛋白經(jīng)100 mmol/L咪唑濃度的washing buffer洗脫除去后，與親和層析柱Ni2+螯合的目的蛋白純度已達(dá)要求。最終，用含500 mmol/L咪唑濃度的washing buffer將融合蛋白溶于其中（圖6）。

2.4 抗血清制備和效價(jià)測(cè)定

用ID-ELISA法對(duì)家兔進(jìn)行免疫前血清本底水平檢測(cè)，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)所選用的新西蘭大白兔（編號(hào)A）血清本底比較低（表1），符合實(shí)驗(yàn)要求。將溶于1×PBS溶液的純化融合蛋白作為免疫原，第一次與完全佐劑等比例混勻，第二、三次與不完全佐劑等比例混勻，采用肌肉與皮下注射相結(jié)合免疫新西蘭大白兔。3次注射后采集血清，以融合蛋白溶液（1 ∶ 10 000稀釋）為抗原進(jìn)行ID-ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)。結(jié)果顯示（表2），本試驗(yàn)制備的多克隆抗血清的效價(jià)大于125 000。

2.5 Western Blot鑒定抗血清特異性

經(jīng)Western Blot抗原抗體結(jié)合反應(yīng)和NBT/BCIP顯色反應(yīng)，兔抗融合蛋白（6×His-AcPmp）的抗血清與IPTG誘導(dǎo)的pET32a-AcPmp表達(dá)菌有特異性反應(yīng)（圖7），其特異性蛋白大小約為37 ku，與預(yù)期大小相符，而與其它雜蛋白條帶均無明顯特異反應(yīng)，表明本研究制備的兔抗融合蛋白抗血清具有較好的特異性。

3 討論與結(jié)論

隨著生物技術(shù)，特別是蛋白分子生物學(xué)的快速發(fā)展，研究學(xué)者們對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)有了顯著的提高。從蛋白的溶解度方面來說，目前常規(guī)純化技術(shù)對(duì)于可溶性蛋白的分析、純化和制備均具有較高的成功率。但對(duì)于一些棘手的不溶性蛋白質(zhì)（如膜蛋白等）的純化研究卻困難重重，如蛋白質(zhì)的活性問題等。近年來，對(duì)于膜蛋白質(zhì)的純化和功能研究等技術(shù)是非常迫切的，這是因?yàn)槟さ鞍自诨A(chǔ)生理過程中（如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子轉(zhuǎn)運(yùn)、能量利用以及細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的維護(hù)）具有極其重要的作用。

利用細(xì)菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白來獲得高純度和高濃度的蛋白已經(jīng)成為一項(xiàng)成熟的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，且可選擇的宿主和載體具有多樣性，這就為不同性質(zhì)的蛋白表達(dá)和蛋白純化奠定了基礎(chǔ)。表達(dá)的外源蛋白主要有2種形式，一種是可溶性的外源融合蛋白，一種是以包涵體形式存在的融合蛋白。這2種不同形式的蛋白進(jìn)行純化時(shí)，主要區(qū)別在于包涵體需要經(jīng)過變復(fù)性處理，而可溶性蛋白則不需要[23]。本研究的檳榔植原體膜蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體的形式存在，但仍有一小部分是可溶的。為了簡(jiǎn)便操作過程和盡量保持融合蛋白的生物活性，我們選擇上清液（可溶性的融合蛋白）進(jìn)行Ni2+-NTA親和層析蛋白純化。在30 ℃的條件下大量誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，取可溶性的上清（含部分融合蛋白）進(jìn)行純化，與佐劑混勻多次免疫新西蘭大白兔，制備高特異高效價(jià)的抗血清。

本研究制備的檳榔植原體膜蛋白多克隆抗血清具有效價(jià)高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，且抗血清將為后續(xù)細(xì)菌雙雜交或酵母雙雜交等實(shí)驗(yàn)的展開奠定基礎(chǔ)。除此之外，現(xiàn)今檳榔植原體的檢測(cè)或診斷基本采用PCR方法[24-25]，而其它的快速檢測(cè)方法較欠缺。與PCR方法相比[24-25]，本研究檳榔植原體膜蛋白多克隆抗血清的制備，是后續(xù)ELISA檢測(cè)方法建立的先決條件，將大大降低檢測(cè)檳榔植原體的費(fèi)用，具有操作簡(jiǎn)單、快速、應(yīng)用范圍廣泛等特點(diǎn)[26]。

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