離子液體對(duì)靶標(biāo)生物和非靶標(biāo)生物AChE的影響

盧嫚 羅帥 韓旭洋 馬玲

（1.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱師范大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150025）お

摘要 ［目的］ 探究不同離子液體對(duì)靶標(biāo)生物及非靶標(biāo)生物體內(nèi)酶活性的影響，明確其對(duì)靶標(biāo)生物的毒殺作用及對(duì)非靶標(biāo)生物的安全性。［方法］研究了3種離子液體對(duì)2種生物體內(nèi)AChE活性的影響。［結(jié)果］ 溴化1慘一3布諄咪唑?qū)π奔y夜蛾AChE活性的影響在獿C20濃度處理下呈抑制趨勢(shì)，獿C50濃度處理下呈先抑制后誘導(dǎo)的趨勢(shì)；對(duì)斑馬魚(yú)肝臟AChE活性的影響在獿C20濃度處理下呈始終抑制趨勢(shì)，在獿C50濃度處理下呈誘導(dǎo)-抑制-誘導(dǎo)的趨勢(shì)。溴化1捕』3布諄咪唑?qū)π奔y夜蛾AChE活性的影響在獿C20濃度處理下呈先抑制后誘導(dǎo)的趨勢(shì)，在獿C50濃度處理下呈抑制趨勢(shì)；對(duì)斑馬魚(yú)肝臟AChE活性的影響在獿C20濃度處理下呈先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì)，在獿C50濃度處理下呈抑制趨勢(shì)。1，2捕甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾AChE活性的影響在獿C20濃度處理下呈先抑制后誘導(dǎo)的趨勢(shì)，在獿C50濃度處理下呈先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì)；對(duì)斑馬魚(yú)肝臟AChE活性的影響在獿C20濃度處理下呈抑制趨勢(shì)，在獿C50濃度處理下呈先抑制后誘導(dǎo)趨勢(shì)。 ［結(jié)論］ 3種離子液體在斑馬魚(yú)和斜紋夜蛾體內(nèi)的積累對(duì)2種生物體內(nèi)AChE的活性均有不同程度的影響，改變生物體內(nèi)神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)，導(dǎo)致生物體嚴(yán)重的行為改變、功能紊亂、癱瘓，從而產(chǎn)生毒害作用。

關(guān)鍵詞 離子液體；AChE酶；斜紋夜蛾；斑馬魚(yú)

中圖分類(lèi)號(hào) SB433文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2014）19-06250-03

お

Impact of Ionic Liquid on the AChE Enzymatic Activity of the Target Organisms and Non瞭arget Organisms

LU Man, MA Ling et al

(Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; Harbin Normal University, Harbin, Heilongjiang 150025)

Abstract［Objective］ To explore the impact on the acetylcholinesterase (AChE) enzymatic activity of different ionic liquids to target organisms and non瞭arget organisms. Clarify its toxic effect on the target organisms and non瞭arget organisms security. ［Method］ Effects of three kinds of ionic liquids on AChE enzymatic activity of both creatures body were studied. ［Result］ Impact on the AChE activity of 1睧thyl3瞞ethylimidazolium Bromide to 玃rodenia litura from view after 獿C20 concentrations were always inhibited trend, after 獿C50 concentrations were from inhibited to induced trend; To liver of 獴rachydanio rerio from view after 獿C20 concentrations were always inhibited trend, after 獿C50 concentrations were induced瞚nhibited瞚nduced trend;1睟utyl3瞞ethylimidazolium Bromide to 玃rodenia litura from view after 獿C20 concentrations were from inhibited to induced trend, after 獿C50 concentrations were always inhibited trend; To liver of 獴rachydanio rerio from view after 獿C20 concentrations were from induced to inhibited trend, after 獿C50 concentrations were always inhibited trend;1,2睤imethylimidazole to 玃rodenia litura from view after 獿C20 concentrations were from inhibited to induced trend, after 獿C50 concentrations were from induced to inhibited trend; To liver of 獴rachydanio rerio from view after 獿C20 concentrations were always inhibited trend, after 獿C50 concentrations were from inhibited to induced trend. ［Conclusion］ Have different levels of impact on three kinds of ionic liquids in 獴rachydanio rerio accumulating and 玃rodenia litura body of two kinds of AChE activity 玦n vivo, in vivo 玞hanges in the conduction of nerve signals, causing organisms severe behavioral changes, disorders, paralysis, resulting in toxic effects.

Key wordsIonic liquids; AChE; 玃rodenia litura; 獴rachydanio rerio

お

基金項(xiàng)目 黑龍江省教育廳項(xiàng)目（12531217）。

作者簡(jiǎn)介 盧嫚（1982- ），女，黑龍江哈爾濱人，講師，碩士，從事森林病蟲(chóng)害防治研究。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事森林保護(hù)研究。

收稿日期 20140603

離子液體是在室溫下為液體的離子化合物，近幾年來(lái)已被開(kāi)發(fā)成一種新型綠色化學(xué)反應(yīng)介質(zhì)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于離子液體的研究主要集中在合成、物化性質(zhì)等領(lǐng)域。斜紋夜蛾（玃rodenia litura）屬鱗翅目夜蛾科又名蓮紋夜蛾，為農(nóng)作物害蟲(chóng)。我國(guó)除青海、新疆未明外，各?。ㄗ灾螀^(qū)）都有發(fā)生。斜紋夜蛾易飼養(yǎng)且發(fā)生世代多［1］、抗氧化性強(qiáng)。

斑馬魚(yú)（獴rachydanio rerio），又名花條魚(yú)、藍(lán)條魚(yú)，原產(chǎn)地為孟加拉國(guó)、印度［2］。它擁有其他模式生物所無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，具有繁殖能力強(qiáng)、體外受精和發(fā)育、性成熟周期短、個(gè)體小、易養(yǎng)殖等諸多特點(diǎn)，成為最重要的模式動(dòng)物之一［3］。斑馬魚(yú)已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各領(lǐng)域［4］，如發(fā)育生物學(xué)［5-8］、遺傳學(xué)［9-10］、腫瘤學(xué)［11］、毒理學(xué)［12-14］等。為此，筆者以斜紋夜蛾和斑馬魚(yú)為研究對(duì)象，研究了3種離子液體分別對(duì)二者體內(nèi)乙酰膽堿酯酶（AChE）活性的影響，以期為開(kāi)發(fā)綠色、高效、安全的新型殺蟲(chóng)劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試藥劑。

1，2捕甲基咪唑、溴化1慘一3布諄咪唑、溴化1捕』3布諄咪唑均購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、丙酮、乙醇、考馬斯亮藍(lán)均購(gòu)于黑龍江哈爾濱益世達(dá)化學(xué)試劑有限公司；碘化乙酰硫代膽堿購(gòu)于Amresco公司；毒扁豆堿購(gòu)于Sigma公司。

1.1.2供試生物。

1.1.2.1斜紋夜蛾。

將購(gòu)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)的斜紋夜蛾成蟲(chóng)飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)，保持溫度（26±1）℃，相對(duì)濕度 60%~70%，光暗周期比為16∶8 h。待卵孵化后，以購(gòu)買(mǎi)的飼料飼養(yǎng)幼蟲(chóng)。選用蟲(chóng)體大小一致、健康的4齡幼蟲(chóng)作為試蟲(chóng)。

1.1.2.2斑馬魚(yú)。

斑馬魚(yú)購(gòu)于哈爾濱市大發(fā)市場(chǎng)。體長(zhǎng)為（2.5±0.2）cm，體重為（0.24±0.05）g。供試用水為經(jīng)過(guò)曝氣處理24 h以上的去氯自來(lái)水，pH為6.5~7.5。試驗(yàn)前，將斑馬魚(yú)在供試用水中馴養(yǎng)7 d，自然死亡率小于1%，水溫在23~27 ℃，試驗(yàn)前1 d停止喂食，在試驗(yàn)期間不投放魚(yú)食，試驗(yàn)用水與之前馴養(yǎng)供試用水一致，光暗周期比為12∶12 h。

1.2 方法

1.2.13種離子液體對(duì)斜紋夜蛾體內(nèi)AChE活性的影響。

1.2.1.1試蟲(chóng)處理。

根據(jù)3種離子液體對(duì)斜紋夜蛾4齡幼蟲(chóng)的毒力測(cè)定結(jié)果［15］，以48 h的獿C50為基準(zhǔn)，選取丙酮液（丙酮∶蒸餾水=2∶1，玍/V）配制成母液，之后再用蒸餾水稀釋成亞致死濃度 獿C20，以相同溶劑作為對(duì)照組。將健康、大小一致的4齡斜紋夜蛾幼蟲(chóng)放入培養(yǎng)皿中，每個(gè)處理15頭，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，分別于觸殺處理 12、24、36、48 h后取樣，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱用于制備酶液。

1.2.1.2 酶液制備。

從每個(gè)處理組中隨機(jī)選取2頭斜紋夜蛾幼蟲(chóng)，加1 ml經(jīng)預(yù)冷過(guò)的提取液，置于冰浴過(guò)的玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿，AchE離心參數(shù)為4 000 r/min，離心15 min，勻漿液為0.2 mol/L PBS（pH 7.5）。

1.2.1.3酶活性測(cè)定。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照Bradford［16］的考馬斯亮藍(lán)G250法。

參照Ellman等的方法［17］，略有改進(jìn)。以1.5 mmol/L碘化硫代乙酰膽堿作底物，AChE水解后產(chǎn)生乙酸和硫代膽堿，與1.0 mmol/L顯色劑DTNB生成黃色物質(zhì)，用0.000 1 ﹎ol/L毒扁豆堿終止反應(yīng)，測(cè)定玂D412值。

1.2.23種離子液體對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)AchE活性的影響。

1.2.2.1斑馬魚(yú)的處理。

根據(jù)羅帥等［18］對(duì)斑馬魚(yú)毒力測(cè)定的方法，通過(guò)試驗(yàn)獲得3種離子液體對(duì)斑馬魚(yú)的毒力測(cè)定結(jié)果，以48 h的獿C50為基準(zhǔn)，選取丙酮液（丙酮∶蒸餾水=2∶1，玍/V）配制成母液，之后再用蒸餾水稀釋成亞致死濃度 獿C20，以相同溶劑作為對(duì)照組。將活潑、大小一致的斑馬魚(yú)投放至5 L玻璃缸中，每個(gè)處理15條斑馬魚(yú)，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)平行試驗(yàn)，分別暴露1、7、14、21 d，然后分別于1、7、14、21 d后隨機(jī)挑取活的斑馬魚(yú)，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱用于制備┟敢?。?/p>

1.2.2.2 酶液制備。

從每個(gè)處理組中隨機(jī)選取2條斑馬魚(yú)，將肝臟解剖出魚(yú)體，加1 ml經(jīng)預(yù)冷過(guò)的提取液，置于冰浴過(guò)的玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿，置于4 ℃離心機(jī)內(nèi)進(jìn)行離心，上層清液即為酶液。AChE離心參數(shù)為4 000 r/min，離心15 min，勻漿液為0.2 mol/L PBS（pH 7.5）。

1.2.2.3 酶活性測(cè)定。方法同“ 1.2.1.3 ”。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理。

用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計(jì)同一時(shí)間處理下不同濃度3種離子液體對(duì)斜紋夜蛾和斑馬魚(yú)的AChE的活性，采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種離子液體對(duì)斜紋夜蛾AChE活性的影響

2.1.1溴化1慘一3布諄咪唑?qū)π奔y夜蛾體內(nèi)AChE活性的影響。

由圖1可知，在12、24、36和48 h時(shí)，經(jīng)過(guò)獿C20濃度處理過(guò)的斜紋夜蛾體內(nèi)AChE的活性均低于對(duì)照組，抑制作用顯著，其中12 h的抑制作用最大，抑制率為52.00%；在12、24、36 h時(shí)經(jīng)過(guò)獿C50處理過(guò)的斜紋夜蛾體內(nèi)AChE的活性均低于對(duì)照組，其中12和36 h時(shí)抑制作用顯著，12 h的抑制作用最大，抑制率為20.34%。48 h時(shí)活性高于對(duì)照組，為對(duì)照組的1.25倍，誘導(dǎo)作用顯著。

注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同字母表示同一時(shí)間不同濃度間在0.05水平差異顯著。

圖1 溴化1慘一3布諄咪唑?qū)π奔y夜蛾AChE活性的影響

2.1.2溴化1捕』3布諄咪唑?qū)π奔y夜蛾AChE活性的影響。

由圖2可知，在12、24、36 h時(shí)，經(jīng)過(guò)獿C20濃度處理過(guò)的斜紋夜蛾體內(nèi)AChE的活性均低于對(duì)照組，抑制作用顯著，其中12 h的抑制作用最大，抑制率為21.28%。48 h時(shí)活性高于對(duì)照組，為對(duì)照組的1.22倍，誘導(dǎo)作用顯著；在12、24、36、48 h時(shí)，經(jīng)過(guò)獿C50濃度處理過(guò)的斜紋夜蛾體內(nèi)AChE的活性均低于對(duì)照組，抑制作用顯著，其中36 h的抑制作用最大，抑制率為29.68%。

注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同字母表示同一時(shí)間不同濃度間在0.05水平差異顯著。

圖2 溴化1捕』3布諄咪唑?qū)π奔y夜蛾AChE活性的影響

2.1.31，2捕甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾AChE活性的影響。

由圖3可知，在12、24、36 h時(shí)，經(jīng)過(guò)獿C20濃度處理過(guò)的斜紋夜蛾體內(nèi)AChE的活性均低于對(duì)照組，且抑制作用顯著，其中12 h的抑制作用最大，抑制率為35.07%；48 h時(shí)活性高于對(duì)照組，為對(duì)照組的1.23倍，誘導(dǎo)作用顯著；在12 h時(shí)，經(jīng)過(guò)獿C50濃度處理過(guò)的斜紋夜蛾體內(nèi)AChE的活性高于對(duì)照組，為對(duì)照組的1.06倍，誘導(dǎo)作用顯著；在24、36、48 h時(shí)，活性均低于對(duì)照組，且抑制作用顯著，其中36 h的抑制作用最大，抑制率為30.29%。

注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同字母表示同一時(shí)間不同濃度間在0.05水平差異顯著。

圖3 1，2捕甲基對(duì)斜紋夜蛾AChE活性的影響

2.2 3種離子液體對(duì)斑馬魚(yú)肝臟AChE活性的影響

2.2.1

溴化1慘一3布諄咪唑?qū)Π唏R魚(yú)肝臟AChE活性的影響。

由圖4可知，經(jīng)過(guò)獿C20濃度處理的斑馬魚(yú)肝臟，酶活性均低于對(duì)照組，斑馬魚(yú)肝臟AChE活性的最低點(diǎn)出現(xiàn)在7 d后，除21 d外，其余均達(dá)到顯著誘導(dǎo)水平，其中7 d的抑制作用最大，抑制率為50.79%；經(jīng)過(guò)獿C50濃度處理過(guò)的斑馬魚(yú)肝臟，在1和21 d后，酶活性均高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的1.11倍和1.12倍，1 d的誘導(dǎo)作用顯著，21 d的誘導(dǎo)作用不顯著；7和14 d后，酶活性均低于對(duì)照組，斑馬魚(yú)肝臟AChE活性的最低點(diǎn)出現(xiàn)在21 d后，7 d的抑制作用顯著，抑制率為20.63%。

注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同字母表示同一時(shí)間不同濃度間在0.05水平差異顯著。

圖4 溴化1慘一3布諄咪唑?qū)Π唏R魚(yú)肝臟AChE活性的影響

2.2.2溴化1捕』3布諄咪唑?qū)Π唏R魚(yú)肝臟AChE活性的影響。

由圖5可知，經(jīng)過(guò)獿C20濃度處理的斑馬魚(yú)肝臟，在1 d后，酶活性高于對(duì)照組，為對(duì)照組的1.11倍，且誘導(dǎo)作用顯著，在7、14和21 d后，酶活性均低于對(duì)照組，除21 d外，有顯著抑制作用，其中第7天的抑制作用最大，抑制率為18.52%；經(jīng)過(guò)獿C50濃度處理的斑馬魚(yú)肝臟，酶活性均低于對(duì)照組，除21 d外，有顯著抑制作用，其中第7天的抑制作用最大，抑制率為13.76%。

注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同字母表示同一時(shí)間不同濃度間在0.05水平差異顯著。

圖5 溴化1捕』3布諄咪唑?qū)Π唏R魚(yú)肝臟AChE 活性的影響

2.2.31，2捕甲基咪唑?qū)Π唏R魚(yú)肝臟AChE活性的影響。

由圖6可以看出，經(jīng)過(guò)獿C20濃度處理的斑馬魚(yú)肝臟，酶活性均低于對(duì)照組，斑馬魚(yú)肝臟AChE活性的最低點(diǎn)出現(xiàn)在7 d后，且均有顯著抑制作用，其中7 d的抑制作用最大，抑制率為53.97%；經(jīng)過(guò)獿C50濃度處理的斑馬魚(yú)肝臟，在1和7 d后，酶活性均低于對(duì)照組，馬魚(yú)肝臟AChE活性的最低點(diǎn)出現(xiàn)在7 d后，均有顯著抑制作用，其中7 d的抑制作用最大，抑制率為23.81%；在14和21 d后，酶活性均高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的1.10倍和1.61倍，且誘導(dǎo)用顯著。

注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同字母表示同一時(shí)間不同濃度間在0.05水平差異顯著。

圖6 1，2捕甲基咪唑?qū)Π唏R魚(yú)肝臟AChE 活性的影響

3 結(jié)論與討論

AChE在靶標(biāo)生物和非靶標(biāo)生物體內(nèi)廣泛存在，其參與生物體內(nèi)神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞，同時(shí)也是有機(jī)磷、氨基甲酸酯類(lèi)等殺蟲(chóng)劑的作用靶標(biāo)。靶標(biāo)生物和非靶標(biāo)生物的生理被農(nóng)藥擾亂，可通過(guò)AChE活性的抑制率來(lái)指示。20%以上的AChE抑制證明毒害作用的存在，50%的AChE抑制表明對(duì)生物的生存有危害［18］。在該試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，除經(jīng)溴化1捕』3布諄咪唑2個(gè)濃度處理過(guò)的斑馬魚(yú)肝臟的AChE活性的最大抑制率低于20%外，其余處理組均出現(xiàn)超過(guò)20%的抑制率的情況，表明溴化1慘一3布諄咪唑、1，2捕甲基咪唑在靶標(biāo)生物斜紋夜蛾和非靶標(biāo)生物斑馬魚(yú)體內(nèi)積累，會(huì)對(duì)其產(chǎn)生一定的毒害作用，溴化1捕』3布諄咪唑在靶標(biāo)生物斜紋夜蛾體內(nèi)積累，會(huì)對(duì)其產(chǎn)生一定的毒害作用。

結(jié)合國(guó)內(nèi)關(guān)于對(duì)斜紋夜蛾和斑馬魚(yú)體內(nèi)AChE活性的影響的研究來(lái)看，匡石滋等［19］研究表明亞致死劑量的毒死蜱、溴蟲(chóng)腈與斜紋夜蛾核型多角體病毒單獨(dú)及混用后對(duì)斜紋夜蛾體內(nèi)AChE活性存在一定影響；趙于丁等［20］研究表明毒死蜱、三唑磷和仲丁威對(duì)斑馬魚(yú)AChE活性存在一定影響，離子液體作為處理藥劑對(duì)上述2種生物體內(nèi)AChE活性的影響的研究較少，而且3種離子液體對(duì)斜紋夜蛾和斑馬魚(yú)體內(nèi)的影響和作用機(jī)理非常復(fù)雜，僅限于對(duì)體內(nèi)1種酶的變化和影響的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，所以3種離子液體對(duì)靶標(biāo)生物和非靶標(biāo)生物體內(nèi)酶活性的影響還需要結(jié)合其他的酶進(jìn)行更深入的研究，同時(shí)探究離子液體與農(nóng)藥混配后對(duì)酶活性的┯跋?。?/p>

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