綬草高頻再生體系建立的研究

李慧玲 蔣倩倩 劉莉莉 高寧 程玉鵬

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）お

摘要

［目的］建立綬草高頻再生體系。［方法］以野生綬草的花序軸為外植體，對外植體進(jìn)行消毒和預(yù)培養(yǎng)后，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6睟A篩選最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基；以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度6睟A和IAA篩選最適增殖培養(yǎng)基；以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度NAA篩選最適生根培養(yǎng)基。［結(jié)果］最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6睟A2.0,最適增殖培養(yǎng)基為MS+6睟A1.5+IAA0.4，最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA1.5。［結(jié)論］該研究對綬草優(yōu)良品種的改良和次級代謝產(chǎn)物研究有重要意義。

關(guān)鍵詞 綬草；再生體系；誘導(dǎo)

中圖分類號 SB188文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06162-01

お

On Establishing a High Frequency Regeneration System of 玈piranthes sinensis

LI Hui瞝ing, CHENG Yu瞤eng et al

(College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin, Heilongjiang 150040)

Abstract ［Objective］ To establish a high frequency regeneration system of 玈piranthes sinensis. ［Method］ With rachis of wild 玈piranthes sinensis 玜s explant, disinfection and preculture was conducted. With MS as basic medium, adding different concentration 6睟A, the optimum induction medium was obtained; with MS as basic medium, adding different concentration 6睟A and IAA, the optimum proliferation medium was selected; with 1/2 MS as basic medium, add different concentration NAA for screen out the optimal rooting medium. ［Result］ The optimum medium for induction is MS+6睟A 2.0; the optimum medium for proliferation is MS+6睟A 1.5+IAA 0.4 and 1/2 MS+NAA 1.5 is the best rooting medium. ［Conclusion］ The study has significance for improvement and secondary metatolites research of 玈piranthes sinensis 玣ine cultivar.

Key wordsSpiranthes sinensis; Regeneration system; Induction

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基金項(xiàng)目 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)校基金（200710）黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)?；穑?01004）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計(jì)劃（2012RCQ13）。

作者簡介

李慧玲（1979-），女，黑龍江北安人，碩士，講師，從事環(huán)境微生物和生物藥物研究。*通訊作者，博士，副教授，從事生物制藥研究。

收稿日期 20140526

綬草（玈piranthes sinensis）屬于蘭科綬草屬植物，別名盤龍參、龍抱柱、豬鞭草等，原國家林業(yè)部頒布的《野生植物保護(hù)名錄》中將其列為二級保護(hù)植物，現(xiàn)已列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》［1］。綬草生長于海拔400~3 200 m的山坡林下或草地，廣泛分布于我國各省區(qū)。綬草根或全草入藥，具有滋陰益氣、補(bǔ)腎壯陽、涼血解毒、潤肺止咳、消炎解毒、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕之功效。用于病后氣血兩虛、少氣無力、陰虛內(nèi)熱、神經(jīng)衰弱、肺結(jié)核咯血、小兒季熱、糖尿病、遺精、頭暈、失眠等癥狀［2］。

綬草中已經(jīng)報(bào)道分離出多種化合物：黃酮類化合物spirathetin并瘛阿魏酸酯如阿魏酸二十八醇酯(octaco瞫ylferulate)、二氫菲類衍生物和甾醇類等［3-5］。其中阿魏酸二十八醇酯已被證實(shí)具有抗腫瘤的作用［3］，二氫菲類衍生物可能具抗乙肝病毒和抗SARS病毒的作用［6］。由于綬草植株瘦小、野生資源較少、有效成分很難提取和富集，這些都限制綬草藥用價(jià)值的進(jìn)一步開發(fā)。因此，建立綬草高頻再生體系，對其優(yōu)良品種的改良和次級代謝產(chǎn)物的研究具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料

以黑龍江鏡泊湖綬草為材料，取其花序軸為外植體。

1.2 方法

1.2.1

外植體消毒和預(yù)培養(yǎng)。將花序軸剪去小苞葉后用流水沖洗15 min，然后用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗4~5次。利用0.1%的氯化汞消毒3、5、7和10 min，用無菌水沖洗4~5次，將花序軸剪成1~2 cm小段接種于MS培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)。每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，培養(yǎng)25 d，統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率和成活率。

1.2.2

外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)。將預(yù)培養(yǎng)后生長良好的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6睟A（0.2、0.6、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/L），每種培養(yǎng)基接種30個(gè)外植體。

1.2.3

誘導(dǎo)芽的增殖培養(yǎng)。將誘導(dǎo)產(chǎn)生的芽接種于增殖培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6睟A（0.6、1.0、1.5、3.0 mg/L）和IAA（0、0.2、0.4、0.6 ﹎g/L）。每種培養(yǎng)基接種30個(gè)誘導(dǎo)芽。

1.2.4

誘導(dǎo)芽的生根培養(yǎng)。

將2 cm以上的芽接種于生根培養(yǎng)基中，以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L），每種培養(yǎng)基接種30個(gè)芽。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基添加蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，pH值為5.8，培養(yǎng)溫度25 ℃，光照2 000 lx，每天12 h光照/12 h┖詘怠＊

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對預(yù)培養(yǎng)的影響

外植體培養(yǎng)25 d后，消毒結(jié)果如表1所示，0.1%的氯化汞消毒效果隨滅菌時(shí)間的增加而加強(qiáng)，外植體消毒10 min污染率為0，消毒7 min外植體出現(xiàn)枯死，消毒10 min枯死數(shù)量明顯增加。鑒于外植體在消毒7 min時(shí)，污染和死亡較少，成活率也較高，所以0.1%氯化汞消毒7 min效果較好。

2.2 最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇

外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基15~18 d后，誘導(dǎo)芽生長情況如表2所示，6睟A濃度在0.2 mg/L時(shí)沒有分化芽；當(dāng)濃度達(dá)到0.6 mg/L時(shí)開始分化芽，但是數(shù)量較少；隨著6睟A濃度的升高芽誘導(dǎo)率增加，當(dāng)6睟A濃B度B達(dá)B到2.0 mg/L時(shí)芽誘導(dǎo)率達(dá)83.3%。因B此外B植體B接種于培養(yǎng)基MS+6睟A2.0最適宜芽的誘導(dǎo)。

表1 外植體的消毒處理

消毒時(shí)間∥min 接種數(shù)∥個(gè) 污染率∥%死亡率∥%成活率∥%

3 30 75 0 25

5 30 34 0 66

7 30 10 13 77

10 30 0 48 52

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表2 外植體的芽誘導(dǎo)率

6睟A濃度∥mg/L 接種數(shù)∥個(gè) 形成芽∥個(gè)芽誘導(dǎo)率∥%

0.2 30 0 0

0.6 30 2 6.7

1.0 30 15 50

1.5 30 18 60

2.0 30 25 83.3

2.3 最佳增殖培養(yǎng)基的選擇

誘導(dǎo)芽在增殖培養(yǎng)基中生長4~5周后的芽增殖倍數(shù)結(jié)果見表3。表3表明，6睟A濃度為1.5 mg/L時(shí)芽的增殖倍數(shù)高于6睟A其他試驗(yàn)組，培養(yǎng)基中添加1.5 mg/L的6睟A和0.4 mg/L的IAA時(shí)芽增殖倍數(shù)最高，因此最佳增殖培養(yǎng)基是MS+6睟A1.5+IAA0.4。

表3 不同培養(yǎng)基的芽增殖倍數(shù)

IAA濃度mg/L 6睟A濃度∥mg/L

0.6 1.0 1.5 3.0

0 2.4 2.7 3.3 1.2

0.2 1.7 2.9 4.6 1.5

0.4 1.3 3.2 4.7 1.8

0.6 1.1 2.1 4.1 2.3

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2.4 最佳誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基的選擇

增殖后的芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)15~17 d開始生根，3周以后觀察生根情況。結(jié)果表明，NAA濃度是1.5 mg/L時(shí)生根率較高，所以最佳生根培養(yǎng)基是1/2MS+NAA1.5。

2.5 煉苗和移栽

組培苗生長到4~6 cm時(shí)，生根3~4條進(jìn)行煉苗，打開培養(yǎng)瓶蓋2~3 d，取出試管苗用水沖洗干凈，洗去根部殘留的培養(yǎng)基，移栽到草炭與蛭石（2∶1）中，注意保持適宜的濕度和遮陰，每周噴施1次MS培養(yǎng)基中的大量元素。經(jīng)過30 d左右，當(dāng)幼苗粗壯、挺拔、根系發(fā)達(dá)后移栽到土壤中。

3討論

綬草屬于蘭科植物，在組織培養(yǎng)過程中經(jīng)常會出現(xiàn)染菌、褐化等現(xiàn)象，究其原因主要與品種、取材部位和取材時(shí)間、外植體大小及傷害程度有關(guān)［7］。所以，在培養(yǎng)過程中需要嚴(yán)格遵照無菌操作規(guī)程，降低污染率。

6睟A是細(xì)胞分裂素，主要作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂和誘導(dǎo)芽的分化，所以誘導(dǎo)芽的生成經(jīng)常在培養(yǎng)基中添加6睟A。NAA是生長素，可以誘導(dǎo)生根，效果較好，所以該研究利用NAA誘導(dǎo)生根達(dá)到了預(yù)期目的。該研究表明，進(jìn)行綬草組織培養(yǎng)時(shí)，最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6睟A2.0，最適增殖培養(yǎng)基為MS+6睟A1.5+IAA0.4，最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA1.5。

參考文獻(xiàn)

［1］ 國家環(huán)境保護(hù)總局.中國珍稀瀕危保護(hù)植物名錄(第一冊)［M］.北京:中國科學(xué)院植物研究所，1987.

［2］《中華本草》編委會.中華本草［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：7916．

［3］ LIN Y L，HUANG R L，DON M J，et al.Dihydrophenanthrenes from 玈piranthes sinensis［J］.Journal of Natural Products，2000，63(12):1608-1610.

［4］ LIN Y L，WANG W Y，KUO Y H.Homocyclotirucallane and two dihydrophenanthrenes from 玈piranthes sinensis［J］.Chemical &Pharmaceutical Bulletin，2001，49(9):1098-1101.

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［6］ LINY L,CHEN W P，ABDULGAFOR D M.Dihydro phenanthrenenes from Bletilla formosana［J］.Chem Pharm Bul，2005，53 (9):1111-1113.

［7］ 陳少珍，卜朝陽，閉志強(qiáng)，等.蘭花組織培養(yǎng)中常見問題及解決方法［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，37(1):72-74.