胡椒果與胡椒葉精油化學(xué)成分分析

張水平 谷風(fēng)林 吳桂蘋 王慶煌

摘 要 采用水蒸氣蒸餾法提取胡椒鮮果、黑胡椒、白胡椒和胡椒葉中的精油，得率分別為1.46%、1.77%、2.30%和1.25%。對精油進(jìn)行GC-MS分析，分別鑒定得到38、31、36和63種化學(xué)物質(zhì)，δ-欖香烯、3-蒈烯、D-檸檬烯、α-古巴烯、石竹烯和律草烯在果與葉中含量均較高，其中葉中δ-欖香烯含量占38.54%；蒎烯、月桂烯、α-水芹烯和間傘花素在果中含量較高，而在葉中含量較低；甘香烯、α-蓽澄茄油烯、β-欖香烯、α-古蕓烯、β-古巴烯、α-蛇床烯、花柏烯、4-異亞丙烯-7-甲基-6-亞甲基-2-辛烯酸甲酯和桉油烯醇在葉中含量較高，而果中含量較低或沒有。此外，采用電子鼻方法可有效區(qū)分胡椒粉和胡椒葉。

關(guān)鍵詞 胡椒；胡椒葉；精油；GC-MS；電子鼻

中圖分類號(hào) TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

胡椒（Piper nigrum L.）是胡椒科胡椒屬多年生常綠藤本植物，是世界上重要的香辛料作物，是人們非常喜愛的調(diào)味品[1]。此外，胡椒也是印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)廣泛應(yīng)用的香辛料藥物之一[2]，具有治療哮喘、慢性消化不良、結(jié)腸毒素、肥胖、鼻竇炎、充血、發(fā)燒[3]、骨端冷、疝氣（痛）、胃?。ㄓ戎嘎裕┖透篂a等的作用[4]。在中醫(yī)藥里，它具有溫中散寒、下氣、消痰的功效[5]。

目前，人們除了把胡椒作為傳統(tǒng)的香辛料外，還開發(fā)研制了胡椒精油等深加工產(chǎn)品，胡椒精油一般作為理療保健用品，供熏香、按摩時(shí)使用[1]，而且價(jià)格較高。胡椒在世界香料作物中占有重要地位，是國際貿(mào)易總量較大的農(nóng)產(chǎn)品之一，且長期以來，國際胡椒市場存在需求旺盛與供應(yīng)不足的矛盾[6]。因此，如果人們能夠從胡椒葉中提取所需精油來替代胡椒果精油，或許可減少胡椒果的需求。

目前對胡椒的揮發(fā)油成分有一些報(bào)道，但少有對胡椒果精油和胡椒葉精油的比較鑒定，在課題組前期胡椒抗氧化能力的比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)胡椒葉的粉末也散發(fā)出胡椒粉氣味。因此，本實(shí)驗(yàn)在同等實(shí)驗(yàn)條件下鑒定比較了海南產(chǎn)鮮胡椒、黑胡椒、白胡椒及胡椒葉的精油成分，為胡椒精油的醫(yī)療保健作用提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)采用電子鼻方法對不同的胡椒粉末進(jìn)行評價(jià)，為海南胡椒的綜合利用提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

胡椒鮮果、胡椒葉采摘于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所基地，胡椒鮮果八、九成熟，凍藏于-25 ℃冰箱內(nèi)；黑胡椒、白胡椒于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所加工；無水硫酸鈉購自廣州化學(xué)試劑廠，正己烷購自廣東光華科技股份有限公司；C8-C25正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品購自Dr. Ehrenstorfer Gmbh Germany。

真空冷凍干燥機(jī)FD-2購自北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；高速萬能粉碎機(jī)QE-300 g購自浙江屹立工貿(mào)有限公司；電子調(diào)溫電熱套98-1-B型購自天津市泰斯特儀器有限公司；布魯克 SCIONTM GC-MS系統(tǒng) 配有NIST 11 Library和MS Workstation 8工作站，購自美國布魯克公司；Alpha M.O.S電子鼻分析系統(tǒng)配有6種金屬氧化物電極和ALPHASOFT 12.0工作站，購自法國Alpha M.O.S公司。

1.2 方法

1.2.1 精油的制備 胡椒鮮果與胡椒葉均真空冷凍干燥，黑胡椒和白胡椒采用40 ℃熱風(fēng)干燥24 h，將4種樣品粉碎，過60目篩待用。參考GB/T 17527-2009提取胡椒精油，稱取約40 g粉末加入1 000 mL圓底燒瓶中，加入防爆沸玻璃珠；然后加入400 mL蒸餾水，自來水回流，保持5滴/min的蒸餾速度；4 h后，待冷卻到室溫，讀取精油體積；最后收集精油，加入無水硫酸鈉4 ℃靜置過夜，保存待用。本實(shí)驗(yàn)中胡椒鮮果用F表示，黑胡椒用B表示，白胡椒用W表示，胡椒葉用L表示。

1.2.2 GC-MS分析 參考Kapoor等[7]的方法，并作稍微改動(dòng)。精油樣品用正己烷稀釋100倍，過0.45微孔膜，液體進(jìn)樣。進(jìn)樣口溫度250 ℃，流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，分流比40 ∶ 1；升溫程序：60 ℃保持1 min，以1.5 ℃/min升溫到185 ℃，保留1 min，再以9 ℃/min升溫到275 ℃，保持2 min。溶劑延遲3 min。全掃描：質(zhì)荷比40-400。正構(gòu)烷烴采用相同方法進(jìn)樣。色譜柱型號(hào)：BR-5 ms 30 meter，0.25 mm ID，0.25 μm df。

1.2.3 電子鼻分析 稱取胡椒果與胡椒葉粉末0.20 g裝入10 mL的頂空瓶中，樣品重復(fù)6次，孵化器溫度70 ℃[8]，孵化時(shí)間300 s，進(jìn)樣針溫度80 ℃，進(jìn)樣量1 000 μL，獲取時(shí)間120 s，延遲時(shí)間210 s。采用判別因子分析法（DFA）分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 保留指數(shù)計(jì)算 保留指數(shù)Retention index（RI）采用C8-C25的系列正構(gòu)烷烴計(jì)算而來。其概念是由Kovats[9]在1958年提出，是把組分的保留值用2個(gè)分別前后靠近它的正構(gòu)烷烴來標(biāo)定，正構(gòu)烷烴的RI與所用色譜柱，柱溫及其它操作條件無關(guān)。1963年van den Dool等[10]引入線性程序升溫保留指數(shù)的概念，公式如下：

RI=100z+100[TR（x）-TR（z）]/[TR（z+1）-TR（z）]

式中：TR（x）、 TR（z）、 TR（z+1）分別代表組分、 碳數(shù)為z及z+1正構(gòu)烷的保留溫度，且TR（z）< TR（x）

當(dāng)GC-MS的結(jié)果給出匹配度都非常高的2種以上的物質(zhì)時(shí)，實(shí)驗(yàn)者就會(huì)對物質(zhì)難以確定，這時(shí)就可以參考文獻(xiàn)中已有物質(zhì)的保留指數(shù)，如果未知物質(zhì)的保留指數(shù)與參考文獻(xiàn)中的相關(guān)物質(zhì)保留指數(shù)相差較少，則二者可能是同一種物質(zhì)，這樣可以增加對未知物質(zhì)的鑒定準(zhǔn)確度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel、Origin、SAS軟件及儀器自帶軟件處理，差異顯著性水平<0.05，平均數(shù)之間的比較采用極差檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 精油得率

相關(guān)研究中胡椒精油的得率情況見表1。本實(shí)驗(yàn)中，黑胡椒精油得率為1.77%（以mL/g進(jìn)行換算），呈藍(lán)綠色；白胡椒精油得率為2.3%，呈淺綠色；鮮胡椒精油得率為1.46%，呈淡綠色；胡椒葉精油得率為1.25%，呈綠色。由表1可知，胡椒葉和胡椒鮮果的精油得率比黑胡椒和白胡椒的精油得率低。

2.2 GC-MS結(jié)果分析

對水蒸氣蒸餾所得的4種精油樣品進(jìn)行GC-MS分析，總離子圖見圖1。由圖1可知，胡椒果與胡椒葉的精油成分的種類和含量差別較大，但胡椒果產(chǎn)品之間的差別不明顯。

采用背景扣除、 自動(dòng)積分（Peak Width ： 4.0sec， Slope Sensitivity： 5， Tangent%： 10， Peak Size Reject： 1 000）和面積歸一化法計(jì)算精油各組分的相對含量。對各峰質(zhì)譜圖進(jìn)行NIST譜庫檢索（Max Rre-Search Hits： 6 000， Max Final Search Hits ： 100， 閾值： 500）和人工譜圖解析，數(shù)據(jù)庫有MAINLIB、REPLIB和TUTORIAL。結(jié)果表明，得到鮮胡椒精油化學(xué)成分38種，黑胡椒精油化學(xué)成分31種，白胡椒精油化學(xué)成分36種，胡椒葉精油化學(xué)成分63種。結(jié)合MS和部分保留指數(shù)，鑒定化學(xué)物質(zhì)見表2。

通過GC-MS數(shù)據(jù)庫搜索和結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，得出胡椒精油中主要含有單萜、倍半萜、芳烴、醇、脂、醚和酮類等物質(zhì)，且面積百分比之和均在99%以上，如表3所示。由表3可知，胡椒果與胡椒葉水蒸氣蒸餾法所得精油的主要成分萜烯類，含量在90%左右，胡椒葉比胡椒果實(shí)含有較多的倍半萜、醇類和脂類。

對4種精油中共有的大量成分進(jìn)行整理，結(jié)果見表4。由表4可知，胡椒果精油中含量最高的是3-蒈烯，蒎烯、檸檬烯、石竹烯和水芹烯的含量次之，月桂烯、間傘花素、δ-欖香烯、葎草烯和α-古巴烯的含量最低；其中除欖香烯、α-古巴烯和葎草烯外，其它成分共有成分在胡椒葉中的含量就明顯低于胡椒果（表4）；同時(shí)還可發(fā)現(xiàn)胡椒葉中的δ-欖香烯的含量非常高。表4中這些大量的共同成分使胡椒果與葉具有相似的氣味，而且這些含量較大的物質(zhì)中有很多具有生物活性。δ-欖香烯具有顯著的抗腫瘤作用[16]； D-檸檬烯具有抗腫瘤、抑菌活性，具有祛痰、止咳、平喘、溶解膽結(jié)石和鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)的作用[17]，復(fù)方檸檬烯在臨床上用于利膽、溶石、促進(jìn)消化液分泌和排除腸內(nèi)積氣。藥理研究結(jié)果表明，石竹烯具有局麻[18]、抗炎[19]等作用。

此外還有一些化學(xué)成分，胡椒葉中含量較多，而果中含量較少（<1%）或者沒有，結(jié)果見表5。它們是甘香烯、α-蓽澄茄油烯、β-欖香烯、β-古蕓烯、β-古巴烯、α-蛇床烯、花柏烯、4-異亞丙烯-7-甲基-6-亞甲基-2-辛烯酸甲酯和桉油烯醇，其中β-欖香烯屬于國家二類非細(xì)胞毒性腫瘤藥物[16]。

2.3 電子鼻結(jié)果分析

對胡椒果與葉的粉末進(jìn)行電子鼻分析，各個(gè)金屬氧化電極對樣品的響應(yīng)值見圖2，各個(gè)樣品的響應(yīng)值RSD<5%，說明樣品的重現(xiàn)性很好。電極T30/1和P30/2對胡椒樣品的響應(yīng)較為敏感。

DFA提供正交線性判別函數(shù)，在實(shí)際應(yīng)用中2個(gè)判別函數(shù)來描述大部分的變量就已經(jīng)足夠了，第1個(gè)判別函數(shù)最能從整體上區(qū)分不同的組，第2個(gè)判別函數(shù)次之。DFA方法的目的就是使組內(nèi)的差別最小化，使組間的差別最大化[20]。電子鼻工作站自帶DFA分析軟件，分析結(jié)果見圖3。由圖3可知，第1個(gè)判別因子和第2個(gè)判別因子的貢獻(xiàn)率分別為61.244%與26.762%；在判別因子1的方向上，胡椒鮮果跟黑胡椒、白胡椒和胡椒葉區(qū)分開來；在判別因子2上，黑胡椒、白胡椒和胡椒葉三者可以區(qū)分開來（圖3）。因此，電子鼻很好地區(qū)分出黑胡椒、白胡椒、冷凍干燥鮮胡椒和冷凍干燥胡椒葉的氣味。

3 討論與結(jié)論

本研究比較了胡椒果與葉的精油成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胡椒果與胡椒葉精油中具有一些相同的含量較大的物質(zhì)，如石竹烯和葎草烯，這使得胡椒果與葉的氣味較為相近；同時(shí)胡椒果與胡椒葉的精油成分也存在較大的差別，雖然二者均以單萜和倍半萜為主要成分，但胡椒葉精油中倍半萜的含量比例高，而胡椒果精油中單萜的含量比例高，此外胡椒葉精油中醇類物質(zhì)和脂類物質(zhì)的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于胡椒果精油的。這些差別使得電子鼻可以區(qū)分出胡椒果與胡椒葉。

此外，本實(shí)驗(yàn)所得胡椒葉精油成分與文獻(xiàn)報(bào)道存在差別。Sumathykutty[15]發(fā)現(xiàn)胡椒葉精油的主要成分是欖香醇，含量占檢出量的11.5%；其次是石竹烯醇，含量占檢出量的4.85%。Bandyopadhyay[21]的研究結(jié)果表明，胡椒葉精油中的主要成分是丁香酚和甲基丁香酚。而本實(shí)驗(yàn)顯示δ-欖香烯可能是胡椒葉精油的主要成分，含量占檢出量的38.54%；其次是石竹烯，含量占檢出量的16.81%。由于精油成分的易揮發(fā)性和不穩(wěn)定性，這個(gè)差別可能跟葉片的干燥方式有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)采用的是真空冷凍干燥，而Sumathykutty[15]采用的是陰干的方法，此外，胡椒栽培地及葉片的采集部位也可能影響結(jié)果。值得一提的是，胡椒葉精油中含有的大量成分δ-欖香烯具有抗癌活性[16]，使胡椒葉具有很高的開發(fā)價(jià)值。

從胡椒果精油中鑒定出的主要成分為α-蒎烯、3-蒈烯、α-水芹烯、D-檸檬烯和石竹烯等，與文獻(xiàn)報(bào)道的主體香氣成分是一致的，如柳中等[11]分析了海南黑白胡椒的香氣成分，得出主體香氣成分為α-蒎烯、3-蒈烯、α-水芹烯、β-月桂烯、D-檸檬烯和石竹烯等物質(zhì)；譚樂和等[22]對胡椒揮發(fā)油的研究結(jié)果表明，胡椒精油的主要成分為3-蒈烯、檸檬烯、反式-石竹烯、β-蒎烯、L-水芹烯、α-蒎烯等。

但也有些報(bào)道與本研究存在較大差異，如邱麗麗等[23]用水蒸氣蒸餾法分析了白胡椒的揮發(fā)性成分，得出其主要成分有（1 S）-3，7，7-三甲基-雙環(huán)[4.1.0]庚-3-烯、石竹烯和D-檸檬烯等；鄭炯等[12]對白胡椒揮發(fā)油的分析得出其主要成分為3-蒈烯、檸檬烯、β-蒎烯、石竹烯、α-蒎烯、1-甲氧基-4-（1-丙烯基）苯、α-水芹烯等萜烯類物質(zhì)；Kapoor等[7]得到黑胡椒精油的主要成分為石竹烯、檸檬烯、蒎烯和香薈烯；Singh等[11]鑒定出黑胡椒揮發(fā)油的主要成分為石竹烯、檸檬烯、香薈烯、β-紅沒藥烯和α-古巴烯；Jirovetz等[14]發(fā)現(xiàn)黑胡椒揮發(fā)油的主要成分為吉馬烯D、檸檬烯、蒎烯、α-水芹烯、β-石竹烯和反式-β-羅勒烯。這些差別可能是由胡椒的產(chǎn)地、采摘時(shí)間、加工方式及實(shí)驗(yàn)條件等因素造成的。

本研究采用GC-MS并結(jié)合部分物質(zhì)保留指數(shù)對精油成分進(jìn)行鑒定，但由于精油成分中有很多物質(zhì)是同分異構(gòu)體，對物質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性有一定的影響，因而有必要對精油中的重要成分（如葉中的δ-欖香烯等）進(jìn)行進(jìn)一步的定性和定量分析，從而為胡椒葉精油的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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