轉(zhuǎn)基因橡膠樹中載體骨架序列的初步研究

李季 黃天帶 蔡海濱 華玉偉 黃華孫

摘 要 以橡膠樹轉(zhuǎn)基因材料為研究對象，首次基于載體左右邊界序列設(shè)計的特異引物進行載體骨架序列的初步PCR檢測，結(jié)果表明，15個轉(zhuǎn)基因陽性株系中有5個和2個株系分別含有左側(cè)和右側(cè)的邊界序列，占33.3%和13.3%，結(jié)合這些株系PCR產(chǎn)物的序列分析結(jié)果進一步證實除T-DNA區(qū)以外的載體骨架序列確實整合到這些株系的植物基因組中。同時對載體骨架序列存在的弊端及可能的解決途徑做了相應(yīng)的分析。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；轉(zhuǎn)基因；載體骨架序列；PCR

中圖分類號 S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

傳統(tǒng)觀點普遍認(rèn)為在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，T-DNA邊界之外的載體序列或載體骨架序列（vector backbone sequences）不可能轉(zhuǎn)移至宿主植物細(xì)胞中[1]，然而，針對多種物種的轉(zhuǎn)基因整合模式的研究結(jié)果表明，T-DNA區(qū)域以外的載體骨架序列經(jīng)常插入到植物基因組中[2-8]。不過有關(guān)骨架序列的整合機制還有待于深入的研究。

研究結(jié)果表明，載體骨架序列整合進植物染色體中可能會產(chǎn)生重組熱點或?qū)е庐惓Ｖ亟M，進而影響目標(biāo)基因的表達(dá)[9]，轉(zhuǎn)基因后代中也易發(fā)生目標(biāo)位點的丟失與表達(dá)沉默等[10-11]。在轉(zhuǎn)基因植物批準(zhǔn)商業(yè)化過程中，決策部門要求提供插入到植物染色體上DNA的全部序列信息，且不能含有載體骨架序列[6]；而且非目的基因外源DNA片段的存在是否造成生物安全性尚無定論，這些都給轉(zhuǎn)基因過程中載體骨架序列的存在產(chǎn)生了負(fù)面影響，也成為了目前植物基因工程研究的熱點之一。

橡膠樹轉(zhuǎn)基因起步相對較晚，目前大多數(shù)的研究主要集中在遺傳轉(zhuǎn)化過程的優(yōu)化、目的基因的整合及表達(dá)情況等方面，對于載體骨架序列的發(fā)現(xiàn)及其整合現(xiàn)象還未見相關(guān)的研究報道。

本研究在對橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株進行陽性鑒定的同時，首次根據(jù)載體左右邊界序列設(shè)計特異引物對載體骨架序列進行了初步的PCR分析，結(jié)果表明在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，載體骨架序列確實隨著T-DNA區(qū)一同轉(zhuǎn)移至橡膠樹基因組中，這也是目前在橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化研究中首次報道。由于載體骨架序列的存在可能會影響基因的表達(dá)及在批準(zhǔn)商業(yè)化時不能存在載體骨架序列，因此，有必要對轉(zhuǎn)基因植物的載體骨架序列進行研究。筆者對橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株中的載體骨架序列進行初步的分析，并對其消除的意義及解決措施做了相應(yīng)的討論，以期在后續(xù)的實驗過程中采取措施加以剔除，達(dá)到僅保留目標(biāo)基因片段與植物染色體融合，最終降低后續(xù)的相關(guān)風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的實驗材料為本課題組于2007～2009年以橡膠樹（Hevea brasiliensis）花藥愈傷組織為外植體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株穩(wěn)定期葉片。26個轉(zhuǎn)基因株系于2011年11月定植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所國家橡膠樹種質(zhì)資源圃，每個株系定植3株，共成活59株；同時以未轉(zhuǎn)化花藥胚為初生胚通過次生體胚發(fā)生增殖后再生的3株組培苗作為對照株系，總計62株。所有材料均經(jīng)過載體上的抗生素特異引物檢測以及GUS染色分析的方法確定其是否為陽性單株，共檢測出15個轉(zhuǎn)基因陽性株系（37份植株），具體檢測結(jié)果見文獻(xiàn)報道[12]。Tj200863、TP0828、T2009519、Tj2008171、T2009626和T2009401六個株系經(jīng)southern檢驗確定目的基因已整合進基因組中（結(jié)果未發(fā)表），這62株均作為載體骨架序列的分析材料。

PCR反應(yīng)所需要的Taq酶購于Fermentas公司，100 bp DNA Ladder購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit購于OMEGA公司，pMDR-19T vector（TaKaRa）購于大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA制備 葉片（穩(wěn)定期）基因組DNA的制備方法參照文獻(xiàn)報道的方法[12]。（1）取兩個離心管蓋大小的葉片直接置于研缽中，加入65 ℃預(yù)熱的600 μL裂解液，研磨至勻漿狀，轉(zhuǎn)移勻漿至2.0 mL的離心管內(nèi)；（2）加入等體積的24 ∶ 1（氯仿 ∶ 異戊醇）進行抽提，無需先用25 ∶ 24 ∶ 1（酚 ∶ 氯仿 ∶ 異戊醇）抽提；（3）加入100 μL的ddH2O和1 μL的RNaseA（10 mg/mL），37 ℃溫浴至DNA完全溶解，不需要進行純化處理，直接置于-20 ℃?zhèn)溆?。DNA的提取質(zhì)量采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 PCR分子檢測 根據(jù)表達(dá)載體左右邊界（LB和RB）附近區(qū)間的序列采用Primer5設(shè)計PCR擴增引物（表1），其中1條引物設(shè)定在T-DNA邊界區(qū)附近（LB引物設(shè)計在T-DNA區(qū)內(nèi)，RB引物設(shè)計在距離T-DNA邊界區(qū)25 bp處），另外1條引物錨定在載體骨架區(qū)（圖1）。對于所用的PCR分子檢測引物優(yōu)先在空白對照、陰性對照以及陽性對照中進行擴增，選擇在空白對照和陰性對照中無擴增產(chǎn)物，僅在陽性對照中能擴增出預(yù)期大小的片段的引物進行轉(zhuǎn)基因植株的檢測。載體骨架序列左右邊界檢測的引物分別命名為TL-L/R和TR-L/R，TL-L/R和TR-L/R擴增的片段大小分別為872 bp和525 bp。引物序列由華大基因合成。

PCR總反應(yīng)體系為15 μL，組成為10×Taq Buffer 1.5 μL，25 mmol/L Mg2+ 1.2 μL；10 mmol/L dNTPs 0.3 μL；5 U/μL Taq酶0.15 μL；10 μmol/L正反向引物各0.3 μL，上述DNA溶液2 μL，滅菌水補足至15 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，引物TL-L/R 67 ℃復(fù)性40 s（引物TR-L/R 66 ℃復(fù)性40 s），引物TL-L/R 72 ℃延伸1 min（引物TR-L/R 72 ℃延伸40 s），35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR檢測時，分別以水做空白對照，未經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的橡膠樹葉片基因組DNA為陰性對照，含有目的基因的表達(dá)載體質(zhì)粒為陽性對照。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的回收 TL-L/R和TR-L/R兩對引物擴增出轉(zhuǎn)基因單株的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇轉(zhuǎn)基因株系中的一個單株擴增的目標(biāo)條帶進行挖膠，用E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit（OMEGA）對目的產(chǎn)物回收，并將回收產(chǎn)物取2 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的克隆與序列分析 將PCR產(chǎn)物回收純化后與pMDR-19T vector（TaKaRa）連接，方法參照載體試劑盒說明書。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，鑒定并挑選至少兩個陽性克隆送至華大基因測序，其中TL-L/R鑒定的轉(zhuǎn)基因植株進行雙向測序，而TR-L/R鑒定的轉(zhuǎn)基因植株進行單向測序即可。測序獲得的序列采用LASERGENE 6.0中的Seqman軟件去除載體序列后進行片段拼接。利用MUSCLE 軟件（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）進行序列數(shù)據(jù)的比對[13]，并用GeneDoc軟件可視化輸出。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR分子檢測

上述62份材料的葉片DNA擴增結(jié)果表明，TL-L/R引物在15份轉(zhuǎn)基因陽性植株（代表5個株系）中擴增出872 bp的片段大小，占轉(zhuǎn)基因陽性株系的33.3%，而非陽性單株和其余22份陽性單株中無擴增產(chǎn)物；TR-L/R引物在6份轉(zhuǎn)基因陽性植株（代表2個株系）中擴增出525 bp的片段大小，占轉(zhuǎn)基因陽性株系的13.3%，而在非陽性單株及其余31份陽性單株中無擴增產(chǎn)物。PCR分析的結(jié)果顯示，含有左側(cè)邊界序列的陽性植株相對較多，而含有右側(cè)邊界序列的轉(zhuǎn)基因植株同時也含有左側(cè)的邊界序列，在15個轉(zhuǎn)基因陽性株系中有2個株系均含有左右邊界的序列。部分樣品檢測的結(jié)果如圖2所示，全部植株檢測結(jié)果如表2所示。

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

將TL-L/R檢測到的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)T55-1、Tj200863-1、Tp0828-1、Tj2008171-1和T2009401-1進行測序，并與pCAMBIA2301載體序列進行比對發(fā)現(xiàn)序列完全一致（圖3-A），該比對結(jié)果說明這些轉(zhuǎn)基因植株中確實存在左邊界的序列整合到植物基因組中。同理，將TR-L/R檢測到的兩株轉(zhuǎn)基因植株P(guān)T55-1和T2009401-1進行測序，與pCAMBIA2301載體序列的右邊界區(qū)域完全一致（圖3-B），說明這兩株植株中，右邊界的序列也隨著T-DNA區(qū)的轉(zhuǎn)移而轉(zhuǎn)移至植物基因組中。但在這些植株中，邊界序列插入到基因組中的片段大小目前還在進一步的研究中。

3 討論

載體骨架序列整合進植物染色體中是轉(zhuǎn)基因植物中的一種普遍現(xiàn)象，并無作物特異性。在擬南芥[3，5，14]、水稻[15]、玉米[16]、煙草[4]、馬鈴薯[17]、棉花[8]和矮牽牛[18]中均有報道。研究結(jié)果表明，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，載體骨架序列與植物基因組之間的整合頻率一般在20%～50%之間，有時甚至高達(dá)75%以上[4，19-20]。本研究左右邊界整合的頻率分別為33.3%和13.3%，相比他人的研究報道來講，骨架序列存在的比例偏低，可能是由于本研究中利用PCR方法結(jié)合測序的方法分析的轉(zhuǎn)基因陽性株系數(shù)目有限，僅為15個株系，因此還需要更多的轉(zhuǎn)基因陽性株系來評估橡膠樹中載體骨架序列的轉(zhuǎn)移比率。

目前，對于載體骨架序列整合進植物染色體的原因還沒有得到一致的結(jié)論，T-DNA鏈從LB處起始覆蓋載體骨架亦或是在RB處開始形成的T-鏈在載體的LB處終止失敗而最終造成通讀（read-through），這兩方面的推測均有相關(guān)的報道[3，6-7，21-22]。

本研究中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽性植株中檢測到左邊界序列的株系明顯高于右邊界序列（分別為33.3%和13.3%），這與De Buck等[6]的研究結(jié)果較為一致，載體骨架DNA多與左側(cè)邊界序列而非右側(cè)邊界串聯(lián)，且有很高比率的轉(zhuǎn)化子含有與左右邊界均相連的載體DNA序列。而本研究還發(fā)現(xiàn)左右邊界序列均有部分整合在植物染色體上的現(xiàn)象，且含有右邊界序列的株系均同時含有左邊界序列，這與Wenck 等[5]的研究結(jié)果一致，右邊界載體骨架序列的整合必然會伴隨著左邊界序列的整合，進而形成整個載體的全部整合。但由于本研究檢測過程中所使用的引物只是距離兩側(cè)邊界序列較近的引物，因此對于這些轉(zhuǎn)基因植株中是否含有整個的載體序列，還將進一步設(shè)計相對較遠(yuǎn)的引物或者利用Tail-PCR的方法確定這些檢測到的轉(zhuǎn)基因陽性株系插入骨架載體片段的大小。目前已經(jīng)獲得少數(shù)植株側(cè)翼序列的結(jié)果（利用Tail-PCR法獲得的PT55-1、T2009401-1左右序列，與本研究中的PCR結(jié)果和測序分析的結(jié)果一致，均為載體骨架區(qū)序列；獲得的HbCBF1-3左右序列經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)均為非載體骨架序列，將獲得的側(cè)翼序列與橡膠樹基因組比較發(fā)現(xiàn)為橡膠樹基因組序列，表明該植株僅為T-DNA區(qū)插入到橡膠樹染色體上，并根據(jù)生物信息學(xué)分析獲得該插入基因全長，為功能未知基因），其余植株的Tail-PCR仍在進行中。待這些側(cè)翼序列均獲得后，可以對所有的插入位點側(cè)翼序列進行生物信息學(xué)分析，初步尋找橡膠樹基因組序列中外源基因整合位點的特征，初步分析整合位點的純合性（目前，根據(jù)側(cè)翼序列以及基因特異性引物組合進行PCR擴增，推測獲得的轉(zhuǎn)基因植株HbCBF1-3為整合位點雜合子）、T-DNA插入是否存在偏愛性（預(yù)示基因組該段DNA序列易于外源基因插入）或是隨機整合性，為外源基因在橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株中整合機制的研究和轉(zhuǎn)基因效率的提高具有重大的意義。

正因為載體骨架序列存在可能會導(dǎo)致一系列的問題存在[6，9-11]，因此對其成功的剔除顯得尤為重要。目前己有或者正在嘗試多種方法來剔除載體骨架序列，如對表達(dá)載體進行改造，即設(shè)計和使用較小的雙元表達(dá)載體用于遺傳轉(zhuǎn)化[23]或篩選只含有T-DNA區(qū)的轉(zhuǎn)基因植株，即構(gòu)建含非T-DNA區(qū)致死基因的載體，篩選或富集只含有T-DNA序列的轉(zhuǎn)基因后代等[24-25]。不過大多數(shù)減少載體非必需DNA序列的方法主要用于煙草和擬南芥等模式植物中，真正普遍應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物還需要很長一段時間[26]。對于橡膠樹而言，載體骨架序列的發(fā)現(xiàn)，要求我們必須對其進行改造剔除，目前本研究室已經(jīng)開展設(shè)計和使用較小的載體進行遺傳轉(zhuǎn)化，還可以嘗試參照模式植物T-DNA區(qū)致死基因的載體研究的思路進行優(yōu)化，以期獲得僅含有T-DNA區(qū)的轉(zhuǎn)基因植株。

參考文獻(xiàn)

[1] Zambryski P C. Chronicles from the Agrobacterium-plant cell DNA transfer story[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant MOI Biol， 1992， 43： 465-490.

[2] Martineau B， Voelker T A， Sanders R A. On defining T-DNA[J]. The Plant Cell， 1994， 6（8）： 1 032-1 033.

[3] van der Graaff E， den Dulk-Ras A， Hooykaas P J J. Deviating T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to plants[J]. Plant Mol Biol， 1996， 31： 677-681.

[4] Kononov M E， Bassuner B， Gelvin S B. Integration of T-DNA binary vector‘backbone sequences into the tobacco genome： evidence for multiple complex patterns of integration[J]. The Plant Journal， 1997， 11（5）： 945-957.

[5] Wenck A， Czakó M， Kanevski I， et al. Frequent collinear long transfer of DNA inclusive of the whole binary vector during Agrobacterium-mediated transformation[J]. Plant molecular biology， 1997， 34（6）： 913-922.

[6] De Buck S， Wilde C D， Montagu M V， et al. T-DNA vector backbone sequences are frequently integrated into the genome of transgenic plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation[J]. Molecular Breeding， 2000， 6： 459-468.

[7] Abdal-Aziz S A， Pliego-Alfaro F， Quesada M A， et al. Evidence of frequent integration of non-T-DNA vector backbone sequences in transgenic strawberry plant[J]. Journal of bioscience and bioengineering， 2006， 101（6）： 508-510.

[8] 馬小波， 王芙蓉， 張傳云， 等. 多位點整合的轉(zhuǎn)基因棉花后代分子鑒定[J]. 棉花學(xué)報， 2008， 20（1）： 9-13.

[9] Iglesias V A， Moscone E A， Papp I， et al. Molecular and cytogenetic analyses of stably and unstably expressed transgene loci in tobacco[J]. Plant Cell， 1997， 9： 1 251-1 264.

[10] Stoger E， Williams S， Keen D， et al. Molecular characteristics of transgenic wheat and the effect on transgene expression[J]. Transgenic Res， 1998， 7： 463-471.

[11] 王利華， 蘇 喬， 包永明. 轉(zhuǎn)基因植物中載體骨架序列的安全性隱患及解決方案[J]. 中國生物工程雜志， 2004， 24（5）： 38-42.

[12] 李 季， 黃天帶， 蔡海濱， 等. 橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株遺傳穩(wěn)定性分析[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2013， （4）： 591-595.

[13] Edgar R C. MUSCLE： multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput[J]. Nucleic Acids Res， 2004， 32： 1 792-1 797.

[14] De Greve H， Nguyen V K， Deboeck F， et al. T-DNA tagging of the translation initiation factor eIF-4Al of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Sci， 2001， 161（4）： 685-693.

[15] Zhu Q H， Ramm K， Eamens A L， et al. Transgene structures suggest that multiple mecha-nisms are involved in T-DNA integration in plants[J]. Plant Sci， 2006， 171（3）： 308-322.

[16] Shou H， Frame B R， Whitham S A， et al. Assessment of transgenic maize events produced by particle bombardment or Agrobacterium-mediated transformation[J]. Mol Breed， 2004， 13（2）： 201-208.

[17] Wolters Am-A， Trindade L M， Jacobsen E， et al. Fluorescence in situ hybridization on extended DNA fibres as a tool to analyse complex T-DNA loci in potato[J]. Plant J， 1998， 13： 837-847.

[18] Cluster P D， O'Dell M， Metzlaff M， et al. Details of T-DNA structural organization from a transgenic Petunia population exhibiting co-suppression[J]. Plant Mol Biol， 1996， 32： 1 197-1 203.

[19] Kuraya Y， Ohta S， Fukuda M， et al. Suppression of transfer of non-T-DNA ‘vector backbone sequences by multiple left border repeats in vectors for transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens[J]. Molecular Breeding， 2004， 14： 309-320.

[20] 成善漢， 謝從華， 柳 俊， 等. 馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系載體骨架的整合分析[J]. 海南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2006， 24（3）： 305-308.

[21] Sallaud C， Meynard D， van Boxtel J， et al. Highly efficient production and characterization of T-DNA plants for rice （Oryza sativa L.）functional genomics[J]. Theor Appl Genet， 2003， 106： 1 396-1 408.

[22] van Haaren M J J， Pronk J T， Schilperoort R A， et al. Functional analysis of the Agrobacterium tumefaciens octopine Ti-plasmid left and right T-region border fragments[J]. Plant Mol Biol， 1987， 8： 95-104.

[23] Xiang C B， Han P， Lutziger， et al. A mini binary vector series for plant transformation[J]. Plant Molecular Biology， 1999， 40（4）： 711-717.

[24] Hanson B， Engler D， Moy Y， et al. A simple method to enrich an Agrobacterium-transformed population for plants containing only T-DNA sequences[J]. The Plant Journal， 1999， 19（6）： 727-734.

[25] 董志峰， 馬榮才， 彭于發(fā)， 等. 轉(zhuǎn)基因植物中外源非目的基因片段的生物安全研究進展[J]. 植物學(xué)報， 2001， 43（7）： 661-672.

[26] 馬小波. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得的轉(zhuǎn)基因棉花基因組中外源基因結(jié)構(gòu)與整合方式[M]. 濟南： 山東師范大學(xué)圖書館， 2007.