芒果炭疽病菌環(huán)境pH信號調(diào)控基因PalF的克隆與分析

賈靜等

摘 要 通過本地查找膠孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）橡膠菌株全基因組測序數(shù)據(jù)，獲得PalF基因的序列信息。利用同源克隆的方法擴增膠孢炭疽病菌芒果菌株P(guān)alF基因，獲得片段大小為2 369 bp的目的基因片段。對該基因序列進行分析發(fā)現(xiàn)，該片段含有完整的開放式閱讀框，與橡膠炭疽菌PalF基因的序列同源性達100%。用RT-PCR的方法獲得PalF基因的cDNA序列，序列進行分析發(fā)現(xiàn)該基因全長為2 310 bp，其中含有1個大小為59 bp的內(nèi)含子，推測編碼769個氨基酸。對PalF基因的氨基酸序列進行推測保守結(jié)構(gòu)域分析可知PalF蛋白中含有Arrestin-C保守結(jié)構(gòu)域，推測該基因參與環(huán)境pH感應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Ambient pH-sensing signal transduetion pathway）的調(diào)控，為進一步研究該基因在環(huán)境pH感應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 芒果；膠孢炭疽菌；pH信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

中圖分類號 Q78 文獻標(biāo)識碼 A

Cloning and Characterization of Ambient pH Signal

Regulatory Gene from Mango Anthracnose

JIA Jing1，2， PU Jinji1， ZHANG He1， QI Yanxiang1， XIE Yixian1 *

1 Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultutal Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

2 Environment and Plant Protection College， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract Based on the complete genome sequence of Colletotrichum gloeosporioides from Rubber and using the traditional homogene cloning method， PalF gene was cloned from C. gloeosporioides of Mango， and the objective gene fragment with the size of 2 369 bp were acquired. The gene sequence analysis showed that it included an intact open reading frame， and had 100% sequence homology with PalF gene of C. gloeosporioides from Rubber. The cDNA sequence of PalF gene obtained by RT-PCR had a length of 2 310 bp encoding a protein of 769 amino acid residues with one 59 bp intron. The analysis of conserved regions of amino acid sequence of PalF gene indicated that PalF protein contains a conservative domain of Arrestin-C， and presumed that PalF gene participated in the regulation of ambient pH-sensing signal transduction pathway which lays the foundation for further study of the gene on the role of ambient pH-sensing signal transduction pathway.

Key words Mango； Colletotrichum gloeosporioides； Ambient pH-sensing signal transduction pathway

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.023

芒果炭疽病（Mango anthracnose），是目前影響芒果產(chǎn)量和品質(zhì)最重要的病害之一。引起芒果炭疽病的主要病原菌為刺盤孢屬膠孢炭疽菌[Colletotrichum gloeosporioides Penz（Penz.）Sacc.]。常造成葉斑、枝條回枯、落花落果，由于其潛伏侵染的特性，在采后貯藏過程中易造成果實腐爛[1]。在病原真菌與寄主互作過程中，寄主組織對環(huán)境pH信號具有調(diào)控作用，而病原真菌則通過環(huán)境pH感應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Ambient pH-sensing signal transduetion pathway）以對不同寄主的pH環(huán)境信號作出響應(yīng)[2-3]。絲狀真菌中環(huán)境pH感應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑由pacC、palA、palB、palC、palF、palH和palI 7個基因介導(dǎo)[3]，其中，環(huán)境pH信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過對轉(zhuǎn)錄因子pacC的介導(dǎo)實現(xiàn)相關(guān)基因的表達調(diào)控；palB有可能是信號依賴性蛋白水解酶，在環(huán)境pH信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到催化作用；palA參與palB對pacC的水解；palH和palI分別有7個和4個推測的跨膜結(jié)構(gòu)域，推測起著感受環(huán)境pH的作用；palI在環(huán)境pH信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到的作用目前還不清楚[3]。PalF蛋白幫助協(xié)助palH蛋白在膜上的定位[4]，PalF基因編碼蛋白是一種阻遏蛋白（Arrestin），在堿性條件下負(fù)責(zé)激活轉(zhuǎn)錄激活因子pacC，這種對堿性pH的應(yīng)答是由保守的信號途徑RIM101途徑控制[5-6]。然而，目前在芒果膠孢炭疽菌系統(tǒng)中尚未開展關(guān)于palF基因有關(guān)的研究，為了明確palF基因在pH感應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用，本研究克隆了膠孢炭疽菌環(huán)境pH信號調(diào)控基因palF，為進一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種和試劑

試驗所需的芒果膠孢炭疽菌A2由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所熱帶果樹病害課題組提供。Recombinant Taq polymerase、pMD18-T Vector、E.coli Competent Cells DH5α、Prime Script High Fidelity RT-PCR Kit均購自寶生物工程（大連）有限公司；Fungal RNA Kit購自O(shè)MEGA公司。引物的合成和測序均委托英駿生物技術(shù)有限公司[Invitrogen Biotechnology（Shanghai）Co.，Ltd.]完成。

1.2 實驗方法

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果膠孢炭疽菌PalF基因的PCR擴增及克隆

根據(jù)膠胞炭疽菌（橡膠菌株）PalF基因設(shè)計引物同源擴增膠孢炭疽菌（芒果菌株）基因組DNA，得到1條預(yù)期的2 000多堿基的條帶，進行切膠回收與克隆轉(zhuǎn)化，測序結(jié)果表明片段大小為2 369 bp（圖1）。用DNAman5.2軟件與膠孢炭疽菌（橡膠菌株）PalF基因序列進行比對，分析結(jié)果表明，兩者堿基序列同源性達100%。該基因序列已經(jīng)提交至GenBank，序列登記號為KF479350。用芒果膠孢炭疽菌PalF基因PCR擴增的特異性引物來擴增PalF基因的表達序列，得到1條約2 300堿基的條帶，進行切膠回收和克隆轉(zhuǎn)化，測序結(jié)果表明大小為2 310 bp（圖2）。

2.2 芒果膠孢炭疽菌PalF基因的序列分析

2.2.1 PalF基因的全長DNA和cDNA序列分析

用DNAman軟件比對分析PalF基因的DNA和cDNA序列，發(fā)現(xiàn)PalF基因中含有1個大小為59 bp的內(nèi)含子，位于第454～512堿基處。

用BioEdit軟件分析可知，PalF基因的cDNA序列雙鏈核苷酸分子量大小為1 406.99 ku，（G+C）mol%為56.88%，（A+T）mol%為43.12%，可知該編碼區(qū)富含GC堿基，其中G和C的摩爾百分含量分別為27.53%和29.35%。

2.2.2 PalF基因蛋白的理化性質(zhì)分析和同源性分析 用ProtParam工具（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）進行分析可知，推測的PalF基因編碼769個氨基酸，分子量大小為 83.05 ku，其中，酸性氨基酸有107個，堿性氨基酸有79個，等電點（PI）為5.27，富含絲氨酸（10.5%）。其疏水性平均值（GRAVY）為-0.611。

用NCBI的Blast軟件對PalF基因推測的氨基酸序列進行比對分析可知，該基因與草莓膠孢炭疽菌pH相關(guān)蛋白Colletotrichum gloeosporioides Nara gc5（ELA35272.1）、鱷梨膠孢炭疽菌pH相關(guān)蛋白Colletotrichum gloeosporioides Cg-14（EQB45210.1）、蘿菔炭疽菌pH相關(guān)Arrestin蛋白Colletotrichum higginsianum arrestin（CCF33501.1）、黃瓜炭疽菌pH相關(guān)Arrestin蛋白Colletotrichum orbiculare MAFF 240422（ENH88457.1）基因編碼蛋白序列同源性較高，相似性達到85%以上。與香蕉尖孢鐮刀菌pH調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白PalF/RIM8 Fusarium oxysporum f.sp.cubense race4（EMT62111.1）、棉花黃萎病菌pH調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白PalF/RIM8 Verticillium dahliae VdLs.17（EGY22961.1）基因編碼蛋白序列同源性為50%以上，主要變異存在于蛋白的N端。推測該基因為pH調(diào)控相關(guān)蛋白。

用ClustalX 1.81和MGEA4.0.1PalF軟件對芒果膠孢炭疽菌PalF蛋白與其他真菌pH調(diào)控相關(guān)阻遏蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明：該蛋白與同屬的草莓膠孢炭疽菌、鱷梨膠孢炭疽菌、黃瓜炭疽菌、蘿菔炭疽菌、禾生炭疽菌聚為一類，其中與草莓膠孢炭疽菌的親緣關(guān)系最近（圖3）。由此推測PalF基因?qū)儆趐H調(diào)控相關(guān)蛋白一類。

2.2.3 PalF基因蛋白的推測保守結(jié)構(gòu)域分析 用NCBI Blast軟件對PalF基因的氨基酸序列進行推測保守結(jié)構(gòu)域分析（圖4），可知PalF蛋白中含有Arrestin-C保守結(jié)構(gòu)域，說明該蛋白屬于阻遏蛋白家族。

2.2.4 PalF基因蛋白的跨膜區(qū)分析 用丹麥科技大學(xué)（DTU）的CBS服務(wù)器上的TMHMM Server v. 2.0程序進行蛋白序列跨膜區(qū)分析（圖5），可知PalF無明顯的跨膜區(qū)，不可能是膜上的受體或定位于膜上。

3 討論與結(jié)論

環(huán)境pH感應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)控真菌的致病性已經(jīng)在構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、油梨炭疽?。–ollletotrichum gloeosporioides）以及酸橙炭疽?。–ollletotrichum acutatum）、芒果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）等多種病原病害系統(tǒng)中得到了深入的研究[3，8]。在構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中，環(huán)境pH信號途徑組件PalF含有兩個具阻遏蛋白特性的N-端和C-端結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域可以與推測的pH感受器PalH，即一種7-跨膜受體（7TM）C端細(xì)胞質(zhì)尾的兩個不同區(qū)域牢固結(jié)合。在堿性環(huán)境中，PalF以一種依賴信號和7TM依賴的方式被磷酸化和泛素化。PalF N-端一個高度保守的絲氨酸殘基如果被取代突變，即可阻止PalF和PalH之間的互作和pH信號傳遞[9]。敲除稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）PalF基因的突變體的致病力顯著降低[5]。在芒果膠孢炭疽病菌中，敲除PalF基因的突變體是否影響芒果炭疽菌的致病力還未見報道，因此需要從芒果炭疽菌中克隆PalF基因，為進一步研究該基因?qū)γ⒐烤揖虏×Φ挠绊懙於ɑA(chǔ)。

本研究采用同源克隆的方法克隆了芒果炭疽菌的pH調(diào)控相關(guān)基因PalF，經(jīng)序列分析可知與橡膠膠孢炭疽菌的PalF基因的同源性達到100%；經(jīng)過Blastp比對得知該基因與pH相關(guān)Arrestin蛋白的相似性達80%以上。目前研究結(jié)果表明絲狀真菌中環(huán)境pH感應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中Arrestin蛋白多為PalF基因編碼的蛋白[6，9]。與香蕉尖孢鐮刀菌、水稻惡苗病菌、棉花黃萎病菌的pH相關(guān)蛋白palF的相似性為50%，該類基因的C-端非常保守，而N-端則存在較大變異。可以推斷克隆的該基因為目的基因PalF。在獲得PalF基因cDNA序列的過程中，采用了半巢式PCR的方法進行了鑒定，經(jīng)比對結(jié)果證實該基因只含有一個大小為59 bp的內(nèi)含子。

根據(jù)本實驗獲得的PalF基因序列，進一步構(gòu)建了基因敲除載體，旨在獲得其基因功能喪失突變體，通過致病性測定芒果膠孢炭疽菌PalF基因在環(huán)境pH感應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的調(diào)控作用。

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