芒果壯鋏普癭蚊同物異名形態(tài)結(jié)構(gòu)及線粒體COⅠ基因證據(jù)

蔡鴻嬌等

摘 要 芒果壯鋏普癭蚊是近年來在中國爆發(fā)成災(zāi)的主要害蟲，2003年被命名為新種Procontarinia robusta Li，Bu & Zhang， 2003。通過對其幼蟲、蛹、成蟲形態(tài)的電鏡掃描觀察以及蟲癭形態(tài)特征觀察，并結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)測定線粒體COⅠ基因片段序列（488 bp），確定了P. robusta與早先報道的P. matteiana Kieffer & Cecconi，1907為同一物種，兩者是同物異名。

關(guān)鍵詞 Procontarinia robusta； Procontarinia matteiana； 同物異名； 電鏡掃描； 線粒體COⅠ基因

中圖分類號 S433 文獻標(biāo)識碼 A

Evidences of Procontarinia robusta Synonyms on Morphological

Structure and the Mitochondrial COⅠ Gene

CAI Hongjiao1， WANG Hongyi2 *， LIAO Furong2， LUO Yujie3， GAO Zhan1

1 Fishery College， Jimei University， Xiamen， Fujian 361021， China

2 Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Xiamen， Fujian 361012， China

3 Xiamen No.1 Middle School， Xiamen， Fujian 361003， China

Abstract Procontarinia robusta Li & Bu & Zhang（Diptera： Cecidomyiidae）has outbroke in recent years and was defined as a new species in 2003. The morphological characteristic of larvae， pupae， adults and galls were observed by scanning electron microscope. Meanwhile， the sequence of 488 bp gene of mitochondrial COⅠ gene was determined to compare within different populaitons. Our study proved that P. robusta and P. matteianan are synonyms from the evidences of morphological structre and the mitochondrial COⅠ gene.

Key words Procontarinia robusta； Procontarinia matteianan； Synonyms； Scanning electron microscope； Mitochondrial COⅠ gene

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.019

世界上芒果癭蚊害蟲有21個物種[1]和10個未知種[2]，在21個已知種中有15種屬于普癭蚊屬（Procontarinia），由于癭蚊的蟲癭容易看見，但是成蟲個體微小很難采集，該屬的分類一直都比較困難。

芒果壯鋏普癭蚊1999年在福建省廈門市島內(nèi)芒果[Mangifera indica L.（Anacardiaceae）]行道樹上首次發(fā)現(xiàn)[3-4]，寄主專一性強，只為害芒果樹，為害嚴重的每個葉片可達到500多個蟲癭數(shù)，受害植株葉片受害率常達100%。2003年通過成蟲形態(tài)描述，由李軍等鑒定為新種Procontarinia robusta Li，Bu & Zhang， 2003[5]，屬雙翅目（Diptera），癭蚊科（Cecidomyiidae），普癭蚊屬（Procontarinai Kieffer & Ceeconi）。近幾年在福建省擴散趨勢逐年增加，導(dǎo)致芒果園產(chǎn)量降低，果樹生長發(fā)育受阻，芒果壯鋏普癭蚊是否是新種或者為入侵害蟲值得商榷。因此通過現(xiàn)有歷史資料比較蟲癭與癭蚊成蟲形態(tài)描述，發(fā)現(xiàn)與早先報道的東南亞地區(qū)印度、印度尼西亞、東帝汶發(fā)生的P. matteiana Kieffer & Cecconi物種相同[6-7]。早在一個多世紀(jì)之前就有文獻對該蟲命名。此外蟲癭形態(tài)與癭蚊物種一一對應(yīng)關(guān)系在很多物種上得到驗證[1]，不同的物種導(dǎo)致蟲癭形態(tài)不同，雖然癭蚊的形態(tài)肉眼很難觀察，但蟲癭的形態(tài)肉眼非常容易判斷從而推斷癭蚊種類，本文從蟲癭形態(tài)特征、幼蟲、蛹的生物學(xué)特性，以及線粒體COⅠⅠ基因來闡述該蟲P. robusta應(yīng)與P. matteianan的同種異名。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 昆蟲采集 以芒果壯鋏普癭蚊成蟲為試驗蟲源，根據(jù)該蟲的地理分布和文獻查詢，選用福建省5個地理種群和東南亞東帝汶種群進行分析（表1）。采集芒果樹上即將羽化的蟲癭葉片，枝條末端棉花加水包裹保濕，放入密封袋內(nèi)，待羽化后收集放入無水酒精離心管中，寫好采集標(biāo)簽，-20 ℃保存?zhèn)溆?。東帝汶島癭蚊物種（P. matteiana）由Peter Kolesik博士提供。

1.1.2 電鏡掃描系統(tǒng) 掃描電鏡型號：TM-1000 SEM（Tokyo， Japan）。用鑷子在解剖鏡下細心撥開蟲癭，挑取幼蟲、蛹待用，從密封袋取出剛羽化的雌雄各3頭，置于蒸餾水中清洗后，經(jīng)過乙醇脫水，自然干燥，用導(dǎo)電膠粘于掃描電鏡樣臺上，噴金，在電鏡下觀察，加速電壓10 kV。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴增及測序 COⅠ基因序列片段（488 bp）提取技術(shù)參考Kolesik等的方法[8]，總DNA提取采用DNA提取試劑盒（購自TaKaRa寶生物工程（大連）生物工程有限公司）。每個地理種群各取3只，每只分別提取DNA，PCR擴增純化及測序，重復(fù)3次。引物為：5′-GGATCACCTGAT

ATAGCATTCCC-3′（COIS）。5′-CCCGGTAAAATTAA

AATATAAACTTC-3′（COIA）[9]。PCR反應(yīng)體系為50 μL：dNTP Mixture（10 mmol/L）1 μL，10×Easy TaqTM Polymerase Buffer（includes 20 mmol/L MgCl2）5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，Easy TaqTM DNA Polymerase（5 U/μL）0.6 μL，模板DNA 6 μL，加滅菌雙蒸水（DDW）至終體積。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，52℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物的克隆與測序委托大連寶生物工程公司完成。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 利用Chroms軟件讀取測序結(jié)果，利用DNAMAN軟件進行拼接及同源性比較，利用MEGA 4.0軟件計算種群內(nèi)及種群件的遺傳距離，并將序列在NCBI上進行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲癭形態(tài)特征

成蟲產(chǎn)卵于葉背，幼蟲孵化后侵入葉肉，刺激葉肉在葉片正面形成圓柱形凸起，而葉背幾乎觀察不到任何癥狀，隨著幼蟲的蟲齡增加蟲癭增大，蟲癭顏色由乳白色逐漸變成淡黃色、深綠色、最后形成堅硬的黑色蟲癭（圖1、2）。幼蟲在蟲癭內(nèi)生長化蛹，生長后期蟲癭頂端形成深褐色圓形蓋子，癭蚊羽化時破殼而出（圖3）。成熟蟲癭直徑約為0.5 mm，高度為1～2 mm（圖4）。癭蚊害蟲具有顯著的為害特征專一性，即特定物種與其形成的蟲癭形態(tài)一一對應(yīng)[1]。Kieffer等將該蟲命名為Procontarinia matteianan[10]。Mani曾描述印度芒果樹上該蟲蟲癭的特征，書中展示的圖238#與廈門本地形態(tài)一致[6]。

2.2 卵、幼蟲形態(tài)特征

卵肉眼基本不可見，產(chǎn)卵于葉背，直徑約為0.14～0.15 mm[11]。幼蟲淡黃色，一共3齡，1齡體長0.15～0.60 mm，2齡體長0.60～1.00 mm，3齡體長1.00～2.10 mm[11]。幼蟲無頭無足型，頭部圓錐形縮入體內(nèi)，胸部3節(jié)，2齡幼蟲可見第一胸節(jié)腹面有一紅褐色三叉戟狀劍骨片，腹部9節(jié)，各一對氣門，腹部側(cè)面有明顯的刺突性鱗片（圖5）。

2.3 成蟲形態(tài)特征

成蟲描述見李軍等[5]及Cai等[2]（圖6）的報道：雄蟲體長具有淡黃色腹部有三條平行的深棕色盾片。觸角鞭節(jié)和腹部均稀疏的覆蓋剛毛。雌雄個體微小，翅展后翅長為1.40～1.90 mm。雄蟲觸角12+2，鞭節(jié)為雙節(jié)型，每個鞭節(jié)近球形，由一圈環(huán)絲和一圈長剛毛組成（圖7）。

雌蟲觸角鞭節(jié)筒狀，基部著生一圈短粗剛毛，中部由一圈波浪狀環(huán)絲纏繞在各結(jié)節(jié)（圖7）。產(chǎn)卵器極短，唇片狀，末端著生一圈長剛毛，其余地方短毛覆蓋（圖8），雄蟲具有強壯的鉗狀抱握器，中間為管狀陽莖（圖8）。其形態(tài)描述特征與Kieffer描述一致[10]。

2.4 COⅠ基因DNA比對

擴增所得的COⅠ基因序列長度為488 bp左右，與預(yù)期的產(chǎn)物大小相近（圖9）。將所得序列進行拼接校對，在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST比對，結(jié)果顯示，所測的序列與昆蟲mtDNA COⅠ基因（癭蚊科，普癭蚊屬等）具有很高的同源性（84%～100%），因此可以確定測定的序列為COⅠ基因序列。不同地理種群癭蚊COⅠ基因可清楚判讀區(qū)域為488 bp。

對不同地理種群的序列進行對比，得到同源性的比較值（表2）。從表2可知，東帝汶、福州、廈門集美、泉州和漳州地區(qū)的芒果壯鋏普癭蚊同源性100%，可以確定P. robusta與P. matteiana為同一物種。與廈門思明地區(qū)的芒果壯鋏普癭蚊僅有2個堿基差異，同源性也校高，外在NCBI上選擇同屬于普癭蚊屬的2個物種比對，與澳洲P. pustulata和日本物種P. mangicola相比，同源性為83.20%～85.45%?？梢源_定本試驗蟲種與P. pustulata和P. mangicola并非同一個物種。

3 討論與結(jié)論

由于癭蚊的個體非常微小，分類鑒定非常困難，但是癭蚊的癭殼特殊專一性是區(qū)別的主要依據(jù)，也就是說每個癭蚊物種的癭殼形態(tài)構(gòu)造差異很大，可作為主要分類依據(jù)之一，雖然前人對癭蚊的成蟲形態(tài)有詳細的描述，但是本文結(jié)合電鏡圖片，更加清晰直觀從癭蚊的為害特性、蟲癭特征、癭蚊各個蟲態(tài)生物學(xué)特性進一步驗證了芒果壯鋏普癭蚊P. robusta與P. matteiana為同物異名，通過分子生物學(xué)技術(shù)測序COⅠ基因片段，兩者的同源性為99.59%，其中東帝汶島與福州、漳州、泉州的地理種群為100%，進一步驗證2個物種為同物異名。Cai等測定顯示P. robusta與東帝汶P. matteiana的 COⅠ基因一致[2]。因此筆者認為P. robusta與P.matteianan應(yīng)為同物異名。通過線粒體COⅠ基因比對，確定了東帝汶與國內(nèi)種群分子水平上沒有差異性。

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責(zé)任編輯：趙軍明