蒲公英多糖測(cè)定方法研究

劉嫻 何曉麗 王倩倩

摘 要：通過對(duì)蒲公英脫脂、除單糖和低聚糖、脫蛋白和精制，得蒲公英多糖精制品，再用蒽酮-硫酸法對(duì)蒲公英多糖含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)研究其重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及加樣回收率。

關(guān)鍵詞：蒲公英多糖；蒽酮-硫酸法；測(cè)定方法

糖類是人類能量的重要來源，分為單糖、雙糖和多糖。多糖是由十個(gè)以上醛糖或酮糖由糖苷鍵結(jié)合起來的糖鏈。多糖不僅能提供能量，也是組成生物體的重要物質(zhì)。多糖具有很多生理活性，

如：排出毒素、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、降血糖、抗輻射等，而且對(duì)正常細(xì)胞無毒副作用，有很高的研究?jī)r(jià)值。

多糖的檢測(cè)方法很多，目前尚無國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。多糖的測(cè)定可分為直接法和間接法。直接法是對(duì)多糖本身進(jìn)行測(cè)定，例如：色譜法、光譜法、生物傳感器法和酶法等。該法分析數(shù)據(jù)精確，有效成分明確，但是操作步驟復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)成本高。間接法是利用多糖的還原性，或是利用酚類或胺類化合物與多糖脫水生成的糠醛發(fā)生縮合反應(yīng)產(chǎn)生特定顏色的性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，例如：硫酸-蒽酮法、苯酚-硫酸法、3，5-二硝基水楊酸法和斐林試劑法等。間接法操作簡(jiǎn)單、快速，不需要昂貴的儀器和特定的酶，因而被廣泛使用。

蒲公英是《藥典》收載的常用中藥之一，也是家喻戶曉的野生蔬菜，在我國(guó)分布非常廣泛。蒲公英富含多糖。文章用硫酸-蒽酮法對(duì)新鮮采摘的蒲公英多糖進(jìn)行測(cè)定，研究測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和回收率的影響，為后續(xù)的研究工作奠定基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1.材料

蒲公英，學(xué)院苗圃園新鮮采摘。

2.試劑

蒽酮試劑：稱1 g蒽酮溶于50 mL乙酸乙酯，棕色瓶保存。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取105 ℃烘干至恒重的葡萄糖0.1000 g，用水定容至1000 mL。

3.儀器

分光光度計(jì)、離心機(jī)、干燥箱、粉碎機(jī)、索氏提取器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

4.方法

（1）蒲公英多糖的提取

①蒲公英預(yù)處理：將新鮮采摘的蒲公英洗凈、烘干、粉碎，過100目篩。

②脫脂：將蒲公英粉末放入索氏提取器中，用石油醚（沸程40 ℃）回流脫脂3 h。

③除單糖和低聚糖：將脫脂蒲公英粉末用80%乙醇回流8 h，除去單糖和低聚糖。

④熱水浸提：把蒲公英處理物按1∶30的比例放入80 ℃熱水中浸提3 h，得蒲公英提取液。共提取2次。

⑤濃縮：用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)蒲公英提取液進(jìn)行濃縮。

⑥脫蛋白：用Sevag法除去蛋白質(zhì)。

⑦醇析：向濃縮液中加入95%乙醇，使乙醇最終濃度為80%。靜置4 h進(jìn)行醇析，4000 r/min離心5 min。沉淀物即為粗多糖。

⑧粗多糖的精制：將粗多糖溶于水，透析36 h，用80%乙醇沉淀多糖，4000 r/min離心5 min。沉淀物再分別用乙醇和丙酮各洗滌3次，干燥得精制多糖。

（2）制備蒲公英多糖樣液

準(zhǔn)確稱取蒲公英精制多糖粉末0.0100 g，用水定容至1000 mL。

（3）蒲公英多糖含量測(cè)定

①繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

取7支25mL比色管，依次加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL，0.10 mL，0.20 mL，0.40 mL，0.60 mL，0.80 mL，1.00 mL，分別加水至2.0 mL，再分別加0.5 mL蒽酮試劑和5 mL濃硫酸，混勻，沸水浴加熱5 min，冷卻。以0號(hào)管為參比管，在620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。以葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

②重現(xiàn)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取蒲公英多糖樣液2.0 mL于25 mL比色管，按①的方法加入試劑，測(cè)定其吸光值。作6個(gè)平行樣。

③穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取蒲公英多糖樣液2.0 mL于25 mL比色管，按照①的方法加入試劑，分別在顯色后10 min，20 min，30 min，1 h，1.5 h，

2 h測(cè)定其吸光值，從而求出多糖含量。

④測(cè)定回收率

準(zhǔn)確吸取蒲公英多糖樣液1.0 mL于25 mL比色管，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加水至2 mL，按照①的方法加入試劑，測(cè)定其吸光值。計(jì)算加樣回收率。

二、結(jié)果與分析

1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見下圖。由下圖可以看出，當(dāng)葡萄糖濃度在0～100 μg/mL時(shí)，葡萄糖的含量與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.重現(xiàn)性試驗(yàn)

根據(jù)測(cè)得的吸光值，計(jì)算得出蒲公英多糖的含量分別為

25.68 g/100 g，25.67 g/100 g，24.76 g/100 g，24.65 g/100 g，25.62 g/100 g，24.72 g/100 g，平均值為24.68 g/100 g，RSD=0.20%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明該方法的重現(xiàn)性良好。

3.穩(wěn)定性試驗(yàn)

在10 min，20 min，30 min，1 h，1.5 h，2 h后測(cè)定的吸光值分別為0.399，0.398，0.400，0.399，0.398，0.399，平均值為0.399，RSD=0.189%，表明蒲公英多糖的測(cè)定在

2h內(nèi)基本穩(wěn)定。

4.回收率試驗(yàn)

由實(shí)驗(yàn)測(cè)定的吸光值，計(jì)算加樣回收率，分別為99.38%，98.76%，

99.05%，99.28%，99.26%，98.35%，平均回收率為99.01%，RSD=

0.40%。表明加樣回收率良好。

三、討論

用蒽酮-硫酸法可以檢測(cè)樣品中所有可溶性多糖，所以，在無

需確定多糖種類的情況下，用該方法無疑是有效和快捷的。唯一的不足之處在于無法測(cè)出不溶性糖類，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏低。用蒽酮-硫酸法測(cè)定蒲公英多糖含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和加樣回收率均在良好的范圍內(nèi)。該方法最好用葡聚糖做標(biāo)準(zhǔn)品，但是葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品在國(guó)內(nèi)很難獲得，所以在實(shí)際應(yīng)用中多以葡萄糖代替，雖然導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高，但是在可控范圍內(nèi)。

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基金項(xiàng)目：合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（zryb

201310）

（作者單位 合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物應(yīng)用技術(shù)系）

編輯 趙飛飛