低濃度鼠李糖脂單糖脂在近中性溶液中的聚集行為

談 菲,劉智峰,鐘 華,曾光明,袁興中 (湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院;環(huán)境生物與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410082)

低濃度鼠李糖脂單糖脂在近中性溶液中的聚集行為

談 菲,劉智峰,鐘 華*,曾光明,袁興中 (湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院;環(huán)境生物與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410082)

研究了臨界膠束濃度(CMC)附近鼠李糖脂單糖脂在近中性溶液中的聚集體粒徑分布.結(jié)果發(fā)現(xiàn),單鼠李糖脂在低于CMC和高于CMC時(shí)均能形成聚集體,根據(jù)粒徑大小分為粒徑在5000nm左右的大粒子、200～500nm的中等粒子和40nm左右的小粒子.當(dāng)pH≤7且濃度低于CMC時(shí),中等粒子的粒徑隨單鼠李糖脂濃度增大而減小,且聚集體在分布上由大粒子向小粒子轉(zhuǎn)變.隨著pH值升高,中等粒子的粒徑也同樣由大變小,且分布上大粒子和中等粒子均向小粒子轉(zhuǎn)變.該結(jié)果被認(rèn)為是聚集體中的單鼠李糖脂分子密度和分子的離解性質(zhì)隨濃度或pH變化所致.

單鼠李糖脂；聚集體；臨界膠束濃度；離解

生物表面活性劑是一種具有親水和親油性的兩親性分子,具有增溶、分散、潤(rùn)濕、滲透特性.鼠李糖脂是銅綠假單胞菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物,具有表面活性劑的通性,在液相環(huán)境中濃度增加能發(fā)生聚集.由于生物表面活性劑具有良好的環(huán)境友好性及生物可利用性,在越來(lái)越多的生活和工業(yè)(如材料、生命、制藥等)領(lǐng)域得到應(yīng)用研究[1-4].

在濃度和溶液pH值變化時(shí),生物表面活性劑所形成的聚集體的結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化.Imura等[5]發(fā)現(xiàn)在高濃度時(shí),隨濃度繼續(xù)升高,甘露糖赤藻糖醇脂依次形成海綿晶格、雙連續(xù)立方晶格和膜結(jié)構(gòu).Ishigami等[6]研究了鼠李糖脂單糖脂和二糖脂在水或磷酸緩沖液中的聚集行為,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH 4.3～5.8時(shí),其聚集物主要以雙層膜的膠囊(Vesicle)形式存在于液相中;當(dāng)pH值升高至6.0～6.5,溶液中出現(xiàn)了鼠李糖脂分子的雙層膜結(jié)構(gòu)(Lamella),并伴隨有脂狀顆粒物的存在;隨著溶液pH值升高至6.8以上,聚集物發(fā)生了有膜結(jié)構(gòu)和脂狀顆粒物向膠束(Micelle)的轉(zhuǎn)化.Champion等[7]用冷場(chǎng)透射電鏡進(jìn)一步確定了在不同pH值的水溶液中60mmol/L鼠李糖脂聚集物的原始形態(tài),并發(fā)現(xiàn)了隨著pH值的升高,聚集物依次發(fā)生了雙層膜或管狀結(jié)構(gòu)、大型雙層膜或單層膜膠囊、小型單層膜膠囊以及膠束的轉(zhuǎn)化.

以上關(guān)于鼠李糖脂在溶液中聚集形態(tài)的研究集中在較高的鼠李糖脂濃度范圍內(nèi)(均高于CMC),而對(duì)CMC附近的鼠李糖脂的聚集行為鮮有涉及.而鼠李糖脂作為一種高效的表面活性劑,在CMC附近即表現(xiàn)出較強(qiáng)的表面活性,Zhang等[8]研究表明,濃度低于CMC的鼠李糖脂單糖脂對(duì)烴類(lèi)就表現(xiàn)出了較強(qiáng)的增溶作用.另一方面鼠李糖脂相對(duì)于一般的化學(xué)表面活性劑生產(chǎn)成本要高,使其在低濃度下發(fā)揮作用可提高其應(yīng)用潛力,彌補(bǔ)生產(chǎn)成本高的不足.鼠李糖脂屬于陰離子表面活性劑,不同pH值下鼠李糖脂的離解度不同,前人研究[9]表明即使在適合微生物生長(zhǎng)的中性pH值附近,pH值的變化也可能顯著影響鼠李糖脂在水溶液中的形態(tài).因此,在近中性pH環(huán)境中濃度在CMC附近鼠李糖脂聚集行為的研究對(duì)它在有機(jī)污染生物修復(fù)中的應(yīng)用具有實(shí)際意義.基于此,本文針對(duì)鼠李糖脂中重要的一類(lèi)——鼠李糖脂單糖脂(簡(jiǎn)稱(chēng)“單鼠李糖脂”)在無(wú)機(jī)鹽溶液中的聚集行為進(jìn)行了研究,考察了近中性pH條件下(6～8),濃度在CMC附近單鼠李糖脂的聚集體粒徑差異,以求進(jìn)一步揭示低濃度鼠李糖脂的聚集行為.

1 材料與方法

1.1 試劑

本研究采用的生物表面活性劑為單鼠李糖脂,采用Zhong等[10]的方法制得,主要成分為RhaC10C10、RhaC10C12-H2和RhaC10C12(物質(zhì)的量比0.80:0.08:0.12).實(shí)驗(yàn)用純水由Lanconco Water Pro PS純水機(jī)(Kansas, USA)制取,電阻率18.2M?·cm.其他試劑均為分析純.

1.2 單鼠李糖脂CMC的測(cè)定

作為背景溶液的MSM溶液成分包括NaNO3(0.20%), KH2PO4(0.15%), Na2HPO4·12H2O (0.15%), MgSO4(0.01%), FeSO4·7H2O (0.001%).

稱(chēng)取一定量的膏狀單鼠李糖脂溶解至MSM溶液中,并用MSM稀釋成不同濃度的單鼠李糖脂溶液,溶液的表面張力采用界面張力儀(JZ-200A,承德儀器廠)之Du Noüy環(huán)法于30℃下進(jìn)行測(cè)定.在單鼠李糖脂濃度0～70μmol/L范圍內(nèi)表面張力測(cè)定的靈敏度<2μmol/L,并且連續(xù)3次測(cè)定誤差在±0.1mN/m之內(nèi).通過(guò)溶液表面張力與單鼠李糖脂濃度之間的關(guān)系曲線得到該生物表面活性劑在MSM中的CMC.

1.3 單鼠李糖脂粒徑測(cè)定

通過(guò)微量注射器用20%的NaOH將不同濃度的單鼠李糖脂MSM溶液的pH值調(diào)至8.0.將溶液通過(guò)0.22μm的微孔濾膜(Millex-HV系列,Millipore Products, Billerica, Ma., U.S.)過(guò)濾,以除去溶液中灰塵等大顆粒雜質(zhì).濾液在帶有紙蓋的小燒杯中靜置2h使其中的單鼠李糖脂聚集體重新達(dá)到分配平衡,然后測(cè)定聚集體的粒徑分布.據(jù)以往類(lèi)似實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在pH 8.0時(shí)溶液中單鼠李糖脂聚集體的粒徑遠(yuǎn)小于0.22μm(后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)),因此可以認(rèn)為過(guò)濾對(duì)單鼠李糖脂聚集體沒(méi)有截留.之后用微孔濾膜過(guò)濾后的20% HNO3溶液通過(guò)微升級(jí)移液槍逐步調(diào)節(jié)單鼠李糖脂的pH值至各目標(biāo)值,在每個(gè)目標(biāo)值下,溶液靜置2h使單鼠李糖脂聚集體重新達(dá)到分配平衡后,進(jìn)行粒徑測(cè)定.由于硝酸濃度很高,加入硝酸溶液的體積相對(duì)于單鼠李糖脂溶液體積可忽略不計(jì),故認(rèn)為調(diào)節(jié)時(shí)單鼠李糖脂濃度不變.粒徑測(cè)定儀器為Zetasizer Nano ZEN3600 (Malvern Instruments, Malvern, U.K.)微粒粒徑測(cè)定儀.測(cè)定基于溶液微小粒子的動(dòng)態(tài)光散射原理,其激光源為633nm的He-Ne激光燈,工作功率4.0mW.樣品由邊長(zhǎng)約1mm的DTS-0012四棱柱聚苯乙烯樣品池盛裝,樣品池插入恒溫測(cè)樣室中30℃下進(jìn)行測(cè)定,散射光于與光路呈173°角處由接收器收集.粒子粒徑通過(guò)累計(jì)量法進(jìn)行計(jì)算,最終數(shù)據(jù)由儀器自帶軟件在SOP模式下分析獲得.最終得到的粒子粒徑為體積平均粒徑,各類(lèi)粒子所占百分比為體積百分比.

2 結(jié)果與討論

2.1 單鼠李糖脂溶液CMC

表面活性劑的臨界膠束濃度CMC是指溶液中表面活性劑分子開(kāi)始大量形成膠束時(shí)的表面活性劑濃度[11].當(dāng)表面活性劑的濃度高于CMC時(shí),溶液中的表面活性劑分子由于疏水基的范德華力作用將會(huì)發(fā)生聚集,形成親水基在表面、疏水基在核心的膠束結(jié)構(gòu),使溶液系統(tǒng)的能量達(dá)到最低狀態(tài).在溶液和空氣的相界面生物表面活性劑分子也達(dá)到飽和,增加其濃度不會(huì)使溶液的表面張力繼續(xù)降低.在單鼠李糖脂濃度低于CMC時(shí),溶液表面張力γst(mN/m)和濃度C(μmol/L)的對(duì)數(shù)值符合線性關(guān)系γst=b-alnC;當(dāng)單鼠李糖脂濃度高于CMC時(shí),溶液表面張力和液相濃度的關(guān)系用常數(shù)方程γst=γst0表示,其中γst0通過(guò)表面張力數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)方差最小化計(jì)算得到[12].

由圖1可見(jiàn),在單鼠李糖脂濃度低于CMC時(shí)隨濃度升高,溶液的表面張力急劇下降,直至單鼠李糖脂濃度降低至CMC時(shí),表面張力將不再隨單鼠李糖脂濃度變化,維持在一個(gè)穩(wěn)定值.低于CMC和高于CMC時(shí),溶液表面張力γst和單鼠李糖脂濃度C之間的關(guān)系分別為γst=69.8-7.379lnC (C≤70μmol/L)和γst=35.4 (C≥80μmol/L),聯(lián)立上述兩個(gè)方程得出單鼠李糖脂的CMC為75μmol/L,這與之前Mata-Sandovala等[13]的研究結(jié)果一致.

圖1 MSM溶液中鼠李糖脂濃度與表面張力之間關(guān)系Fig.1 Relationship between surface tenstion and concentration of monorhamnolipid in MSM

2.2 單鼠李糖脂在MSM溶液中的粒徑分布

由圖2可見(jiàn),不同pH值和濃度下單鼠李糖脂可以是1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)粒徑范圍的聚集體.通過(guò)對(duì)Zetasizer Nano ZEN3600儀器軟件對(duì)圖線的積分分析,可以得到每類(lèi)聚集體的平均粒徑及其體積占所有粒子總體積的百分比.

單鼠李糖脂在MSM中的聚集體可能的形態(tài)共有3種,分別粒徑5000nm左右的大粒子c、粒徑200～500nm的中等粒子b和粒徑40nm左右的小粒子a,且即使在濃度低于CMC (75μmol/L)時(shí)也檢測(cè)到了聚集體的存在.由圖3可見(jiàn),在各pH值下,隨著單鼠李糖脂濃度的增加,大粒子c粒徑保持5000nm左右沒(méi)有明顯變化,中等粒子b在濃度低于CMC時(shí)隨濃度的增加粒徑減小,在高于CMC時(shí)基本不變.除了pH=6.0的情況,小粒子a的粒徑隨濃度沒(méi)有明顯變化(左圖).對(duì)于粒子的分布,在某一pH值下,隨著濃度的增加,一般地有大粒子c和中等粒子b的體積百分比減小,而小粒子a的體積百分比增加(右圖).由于分子中羧基的存在, 單鼠李糖脂屬陰離子表面活性劑,在水溶液中能夠離解,它在常溫下的離解平衡常數(shù)Ka=10-5.6[6],在實(shí)驗(yàn)pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0時(shí),單鼠李糖脂在MSM中的離解度分別為71.5%, 88.8%, 96.2%, 98.8%,和99.6%.不考慮無(wú)機(jī)鹽等其他因素的影響,在固定pH下,單鼠李糖脂的離解度是一定的,其粒徑的變化由濃度的變化引起.隨著濃度的升高,粒子的粒徑減小,粒子表面單位面積單鼠李糖脂分子密度增加,同時(shí)小粒子的數(shù)目增加,這對(duì)于系統(tǒng)的熱力學(xué)穩(wěn)定性有利.

圖2 不同pH和濃度條件下單鼠李糖脂在MSM溶液中的聚集體體積頻度分布Fig.2 Size volume distribution of monorhamnolipid aggregates under different conditions of pH and rhamnolipid concentration

圖3 單鼠李糖脂在不同pH值的MSM溶液中的聚集體粒徑及體積分布Fig.3 Size of co-aggregates and volume distribution in MSM of monorhamnolipid with different pH

由于單鼠李糖脂的離解度受溶液pH值的影響較大,pH值對(duì)單糖脂聚集體的粒徑分布有較大影響.各濃度下,大粒子c的體積百分比基本隨pH值的增加而降低,至pH 8.0時(shí)完全消失;中等粒子b的體積百分比基本隨pH值的增加而降低,在pH 6.5至pH 7.0段降低迅速,并且在pH7.5時(shí)完全消失;小粒子a的體積百分比隨pH值的增大而增加,直至pH8.0時(shí)聚集體完全以小粒子形式存在(右圖).隨著MSM溶液pH值的增大,溶液中離子態(tài)的單鼠李糖脂比例增加,聚集體表面單鼠李糖脂分子之間的靜電斥力增大,使得膠團(tuán)曲率變大,粒徑變小,同時(shí)也促進(jìn)了大粒子向小粒子的轉(zhuǎn)化.因此,隨著pH的增加,單糖脂的粒子b的粒徑在各濃度下都有減小的一般規(guī)律,同時(shí)大粒子和中等粒子向小粒子轉(zhuǎn)化.Champion等研究表明,在高濃度(60mmol/L)的單鼠李糖脂溶液中,隨pH值從6.0增大到8.0,其聚集形態(tài)發(fā)生了由大型雙層膜膠囊、大型單層膜膠囊、小型單層膜膠囊直至膠束的變化[14].而本研究顯示,在低濃度下(CMC左右),隨著pH值的增加其聚集形態(tài)也發(fā)生了由大到小的變化,與之一致.

以上結(jié)果表明,對(duì)于生物表面活性劑鼠李糖脂單糖脂,在其濃度低于CMC時(shí)溶液中形成了多種粒徑的聚集體.一般認(rèn)為,低分子表面活性劑形成的膠束粒徑在10nm以下,但本研究中的單鼠李糖脂在低濃度范圍內(nèi)能夠形成粒徑達(dá)5000nm的大型聚集體結(jié)構(gòu),而在高濃度范圍內(nèi),卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)粒徑小于10nm的聚集體.這與單鼠李糖脂分子結(jié)構(gòu)有關(guān).單鼠李糖脂的親水基/疏水基比例較小,在分子構(gòu)型上可能形成了和磷脂分子POPE類(lèi)似的親水基位于頂角的正三角形結(jié)構(gòu)[14],這樣的構(gòu)型使得單糖脂分子在溶液中形成的聚集體表面曲率更小,疏水基之間的作用更強(qiáng),形成的聚集體粒徑也比較大.因此低于CMC形成的這種聚集體很可能不是實(shí)際意義上的膠束結(jié)構(gòu),而是其它的結(jié)構(gòu)形式,如與磷脂分子或甘露糖赤藻糖醇酯等生物表面活性劑分子類(lèi)似,形成雙層膜和膠囊結(jié)構(gòu)[15-16].

3 結(jié)論

3.1 在濃度低于和高于CMC時(shí),單鼠李糖脂在溶液中均能形成聚集體,但兩種聚集體結(jié)構(gòu)上可能存在差別.

3.2 隨著濃度和pH值的增加,聚集體的粒徑均有由大變小的一般規(guī)律,且小粒徑聚集體的體積百分比增加,這分別是單鼠李糖脂聚集體分子密度的改變以及單鼠李糖脂的離解引起的分子電性變化所導(dǎo)致的結(jié)果.

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Aggregation of monorhamnolipid with concentrations near CMC in neutral solution.

TAN Fei, LIU Zhi-feng,ZHONG Hua*, ZENG Guang-ming, YUAN Xing-zhong (College of Envirnmental Science and Engineering, Key Laboratory of Environmental Biology and Pollution Control, Ministry of Education, Hunan University, Hunan 410082, China). China Environmental Science, 2014,34(11)：2912～2916

Size distribution of monorhamnolipid aggregates in neutral pH solutions with rhamnolipid concentration near critical micelle concentration (CMC) was studied. Aggregates were formed when rhamnolipid concentration was either below or above CMC. Three types of aggregates which were large (d=5000nm), medium (d=200～500nm) and small (d=40nm) in size were found. When pH was below 7.0 and the rhamnolipid concentration was below CMC, size of the medium-size aggregates decreased with increasing rhamnolipid concentration, and large-size and medium-size aggregates transformed into small-size aggregates. With the increase of solution pH, size of the medium-size aggregate also decreased, and large-size and medium-size aggregates transformed into small-size aggreqates. These observations were assumed to result from change of density and dissociation degree of monorhamnolipid molecule in the aggregates with rhamnolipid concentration and solution pH.

monorhamnolipid；agreegates；critical micelle concentration；dissociation

X131.2

A

1000-6923(2014)11-2912-05

談 菲(1991-),女,湖南長(zhǎng)德人,湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院碩士研究生,主要從事水環(huán)境污染生物修復(fù)技術(shù)研究.

2014-04-27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(50908081,51039001, 51378192,51308200,51378190)

* 責(zé)任作者, 講師, zhonghua@hun.edu.cn