正交試驗(yàn)優(yōu)選雙花抗病毒口服液提取工藝

胡玉良 楊素紅 鄧健安

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院，廣東 中山 528400）

正交試驗(yàn)優(yōu)選雙花抗病毒口服液提取工藝

胡玉良 楊素紅 鄧健安

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院，廣東 中山 528400）

目的：優(yōu)選雙花抗病毒口服液的提取工藝。方法：采用L9（34）正交試驗(yàn)篩選提取工藝；以加水量（A）、提取時(shí)間（B）、浸泡時(shí)間（C）作為考察因素，以揮發(fā)油提取量為指標(biāo)，優(yōu)選廣藿香、魚(yú)腥草、連翹3味藥材的揮發(fā)油提取工藝；以加水量（A）、浸泡時(shí)間（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，以綠原酸和連翹苷含量為指標(biāo)，優(yōu)選藥材的水提工藝。結(jié)果：揮發(fā)油最佳提取工藝為：加10倍量水，直接提取4小時(shí)；水提取最佳工藝為：加8倍量水，浸泡0.5小時(shí)，煎煮2次，每次1.5小時(shí)。結(jié)論：優(yōu)選得到的提取工藝質(zhì)量穩(wěn)定、可行。

雙花抗病毒口服液；揮發(fā)油；綠原酸；連翹苷；提取工藝；正交試驗(yàn)

雙花抗病毒口服液為本院院內(nèi)制劑，由金銀花、野菊花、魚(yú)腥草、板藍(lán)根、廣藿香、連翹等11味中藥組成。由于目前制劑制備工藝為水煮醇沉，魚(yú)腥草、廣藿香、連翹等藥材揮發(fā)油含量高，有效成分易流失，故采用水蒸氣蒸餾法先行提取揮發(fā)油，藥渣再與其余中藥進(jìn)行水提的工藝路線(xiàn)[1]，對(duì)主要工藝參數(shù)進(jìn)行正交試驗(yàn)，篩選出最佳的提取工藝。

1 儀器與試藥

揮發(fā)油提取器（上海求精玻璃儀器廠(chǎng)）；DZTW型調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器廠(chǎng)）；BS224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司d=0.000 1 g）；Agilent 1100系列高效液相色譜儀；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201314，中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所）；連翹苷對(duì)照品（批號(hào)：110821-201213，中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所）；甲醇、乙腈為色譜純；水為重蒸餾水。其余試劑為分析純。所用藥材均購(gòu)于廣東致信藥業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定符合《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取工藝研究[2]

2.1.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選用對(duì)揮發(fā)油提取影響較大的加水量（A）、提取時(shí)間（B）和浸泡時(shí)間（C）作為考察因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平

2.1.2 試驗(yàn)方法與結(jié)果取連翹30 g、魚(yú)腥草30 g、廣藿香15 g，按表1試驗(yàn)序列號(hào)各條件分別進(jìn)行提取，收集揮發(fā)油，讀取揮發(fā)油量。結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 揮發(fā)油提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 揮發(fā)油提取工藝方差分析

2.1.3 結(jié)果分析由表2可知，影響實(shí)驗(yàn)因素依次為：B＞ A＞C，且A2＞A1＞A3，B3＞ B2＞ B1[13]，C1＞ C3＞ C2，可初步得到最佳工藝條件為A2B3C1。由表 3方差分析也可以看出提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油的提取量有顯著性影響（P＜0.05），而其他兩個(gè)因素對(duì)揮發(fā)油提取量的影響都無(wú)顯著性意義（P＞0.05），故A2B3C1為揮發(fā)油提取工藝最佳方案。

2.1.4 驗(yàn)證試驗(yàn)取藥材按正交試驗(yàn)得到的最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證，即加入10倍水，提取4小時(shí)，平行試驗(yàn)3次。為考察提取是否完全，試驗(yàn)后再提取1小時(shí)。結(jié)果見(jiàn)表 4。

表4 揮發(fā)油提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，提取4小時(shí)揮發(fā)油已提取完全，所選提取條件穩(wěn)定可行。

2.2 水提工藝研究[3]

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)水提工藝選取了加水量（A）、浸泡時(shí)間（B）、提取時(shí)間（C）和提取次數(shù)（D）作為考察因素，每個(gè)因素分別設(shè)計(jì)3個(gè)水平，以綠原酸和連翹苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用 L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。見(jiàn)表5。

表5 水提工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平

按照處方比例，稱(chēng)取除連翹、魚(yú)腥草、廣藿香外的藥材，加入提取揮發(fā)油后的藥渣，按照正交試驗(yàn)安排表進(jìn)行試驗(yàn)，收集提取液，合并提取液和提取揮發(fā)油后的藥液，濾過(guò)，濾液濃縮至100 mL，即得樣品。

2.2.2 綠原酸含量的測(cè)定[4]

2.2.2.1 色譜條件 色譜柱為 Boston Green ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（12∶88），檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min[15]。色譜見(jiàn)圖1。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取樣品2 mL，置50 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶液至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取 11.2 mg綠原酸對(duì)照品，置100 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得0.112 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取2 mL置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2.4 測(cè)定法 分別精密量取對(duì)照品溶液及供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀，測(cè)定綠原酸含量。

2.2.3 連翹苷含量的測(cè)定[4]

2.2.3.1 色譜條件 色譜柱為 Boston Green ODS（4.6 mm ×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（25∶75），檢測(cè)波長(zhǎng) 277 nm，柱溫 30 ℃，流速1.0 mL/min[16]。色譜見(jiàn)圖2。

圖1 綠原酸的高效液相色譜

圖2 連翹苷的高效液相色譜

2.2.3.2 供試品溶液的制備 精密量取樣品1 mL，加在中性氧化鋁柱（100～ 120目，1 g，內(nèi)徑為1 cm）上，用90%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取連翹苷對(duì)照品10.5 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.21 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取2 mL置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3.4 測(cè)定法 分別精密量取對(duì)照品溶液及供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀，測(cè)定連翹苷含量。

2.2.4 結(jié)果與分析正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析情況見(jiàn)表6～ 8。

表6直觀(guān)分析結(jié)果表明，提取次數(shù)是最主要的影響因素。以綠原酸含量為指標(biāo)，根據(jù)各因素各水平的K值比較，初步確定最佳工藝為 A3B2C2D3，即藥材加 12倍水，浸泡 0.5 h，提取 3次，每次1.5 h；以連翹苷含量為指標(biāo)，根據(jù)各因素各水平的K值比較，初步確定最佳工藝為A1B2C2D3，即藥材加8倍水，浸泡0.5 h，提取3次，每次1.5 h。從表7、表8方差分析可知，提取時(shí)間對(duì)綠原酸含量和連翹苷含量都有顯著影響，加水量只對(duì)連翹苷含量有顯著意義，從節(jié)約成本角度來(lái)看，最終確定水提取工藝為 A1B2C2D2，即藥材加 8倍水，浸泡0.5 h，提取 2次，每次1.5 h。

2.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)根據(jù)所選的最佳提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。綠原酸含量分別為 0.157，0.156，0.147 mg/mL，平均含量為0.153 mg/mL。連翹苷含量分別為0.117，0.113，0.111 mg/mL，平均含量為0.114 mg/mL。說(shuō)明該工藝科學(xué)合理，質(zhì)量穩(wěn)定。

表6 水提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 綠原酸含量方差分析（R2=0.967；調(diào)整R2=0.937）

表8 連翹苷含量方差分析（R2=0.960；調(diào)整R2=0.925）

3 討論

連翹為果實(shí)類(lèi)藥材，有效成分的提出比較慢，但提取揮發(fā)油時(shí)已經(jīng)經(jīng)歷了一次水提，有效成分已經(jīng)大部分被提取了，在水提工藝中，又被提取兩次，連翹苷基本提取完全。金銀花和野菊花為花類(lèi)藥材，有效成分的提出比較快，水提兩次也基本提取完全。

對(duì)按原工藝進(jìn)行3次試驗(yàn)和按優(yōu)選工藝驗(yàn)證試驗(yàn)的樣品進(jìn)行質(zhì)量比較，結(jié)果原工藝樣品中揮發(fā)油鑒別斑點(diǎn)均弱于優(yōu)選工藝樣品；綠原酸含量分別為 0.138，0.129，0.140 mg/mL，平均含量為0.136 mg/mL，連翹苷含量分別為 0.101，0.105，0.098 mg/mL，平均含量為 0.101 mg/mL，均低于優(yōu)選工藝樣品。證明優(yōu)選工藝能夠提高制劑有效成分的得率，提高了制劑質(zhì)量。

[1] 宋敏，李峰，李清芳.抗病毒口服液制備工藝及臨床療效評(píng)價(jià)[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2001，20（4）：44-45.

[2] 鄧麗明，林華慶，劉國(guó)宏，等.抗病毒口服液揮發(fā)油提取工藝的研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，23（2）：119-120.

[3] 王劍林，王冰.正交設(shè)計(jì)優(yōu)選抗病毒口服液的提取工藝[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010，8（6）：28-30.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

Optimization of Extraction Process of Shuanghua Kangbingdu Oral Liquid by Orthogonal Test

Hu Yuliang，Yang Suhong，Deng Jianan
（Zhongshan Hospital of Guangzhou University of TCM，Guangdong Zhongshan 528400，China）

Objective:To study the optimal extraction process of shuanghua kangbingdu oral liquid.Methods:Orthogonal design was carried for screening the extraction process.Water volume,extracting time and soaking time were used as the investigating factors and the yield of volatile oil as index to select the optimal extracting condition for volatile oil from patchouli,houttuynia cordata and forsythia,and with water addition,soaking time,extraction time and extraction times as factors,and the content of phillyrin in chlorogenic acid as the evaluation index to select the optimal extracting process for water.Results:The optimal extraction conditions for volatile oil included 4 hours of extraction with 10 times of water volume,the optimal extracting process for water was 0.5 hour of soaking time with 8 times of water volume and decoction 2 times,1.5 hour each time.Conclusion:The optimized extraction process is stable with a good feasibility.

Shuanghua Kangbingdu Oral Liquid；Volatile Oil；Chlorogenic Acid；Forsythin；Extraction Process；Orthogonal Test

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.10.004

2014-07-10）

中山市醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目（2014A020274）

胡玉良，女，主管藥師。研究方向：制劑工藝與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。通訊作者E-mail：hyliang2010@139.com